Impact of Antibody Activity and Sample Stability on Protein Expression Profiling Using Antibody Microarrays

Abstract

Antibody microarray is a tool used for protein expression profiling that takes advantage of the high specificity of antibodies. The tool has numerous of potential applications, such as detection of disease biomarkers, but also has some potential limitations that must be considered. Variations in antibody activity between different production batches and altered analyte levels in samples due to improper sample handling can hypothetically affect the outcome of the assay. This study have investigated these aspects by producing 28 single chain fragment variable antibodies in three independent batches and using these to produce antibody microarrays. Variations in activity were analysed using serum samples. By exposing serum samples to either repeated freezing and thawing or storage in room temperature before analysis, the impact of sample stability was examined. The results strongly indicated that batch-batch variations were a problem that must be addressed. Some of the observed variations were linked to differences in spot concentrations, but others were due to variations in the on-chip activity. The dispersities of the antibody solutions were investigated and rejected as an explanation to these activity variations. Therefore, the reason why the on-chip activity differs should be further examined so that strategies on how to handle the observed variations can be defined. Improper handling of the samples did not affect the levels of analytes to such an extent that the reliability of the assay was compromised. However, these results need to be confirmed targeting both a wider range of analytes as well as a larger set of samples from sick and healthy individuals.

Popular Abstract (Swedish)

En viktig del av kroppen immunsystem är antikroppar, ett protein med förmåga att känna igen en specifik struktur på en annan molekyl (antigen). Varje antikropp känner igen ett specifikt antigen och binder hårt till detta när det påträffas. På så sätt märker antikroppar ut exempelvis bakterier så att de kan elimineras av andra delar av immunförsvaret. Antikroppars unika egenskaper har visat sig gå att utnyttja i en mängd olika tekniska verktyg. Ett exempel på ett sådant verktyg är antibody microarray. I denna teknik droppas små mängder av flera olika sorters antikroppar på en yta. Då bildas ett mönster av punkter, en array, där var och en av punkterna innehåller en typ av antikropp. När ett prov sedan läggs på arrayen binder antikropparna till deras respektive antigen i provet. Genom att analysera hur mycket antigen som har bundit till de olika antikropparna fås information om vad som funnits i det undersökta provet. För antibody microarrays finns många potentiella användningsområden så som diagnostisering av sjukdomar och som underlag för val av lämplig behandling av en patient. Det finns dock fortfarande ett antal förbättringsmöjligheter av tekniken. Ett potentiellt problem rör produktionen av antikroppar och arrayer. Om dessa produceras vid olika tillfällen finns det en risk att antikropparna är olika aktiva när de droppas till arrayer på ytan. Ett annat potentiellt problem är de prover som undersöks i en studie oftast är serumprover som kommer från olika kliniker eller biobanker. Därför är det ofta okänt för forskaren hur proverna har behandlats. Det har tidigare visats att olika behandling av prov (upprepad frysning och tining samt längre förvaring i rumstemperatur) kan påverka innehållet av olika antigen i provet. Båda dessa eventuella problem kan påverka det resultat som tekniken ger. Om antikropparna som används har olika aktivitet på ytan eller om innehållet i provet förändrats på grund av behandlingen av provet så påverkas resultatet som fås. Detta skulle eventuellt kunna leda till feldiagnostisering eller fel val av behandling för en patient.
För att utreda effekterna av dessa två problem har tre olika batcher av varje antikropp (28 stycken) producerats separat från varandra. Dessa tre batcher har sedan använts för att göra antibody microarrays. Aktiviteten hos var och en av batcherna har analyserats med hjälp av serumprov från tre friska donatorer. För att undersöka effekterna av avvikande hantering av proverna har serumprover från samma donatorer blivit frysta och tinade upprepande gånger eller förvarade i rumstemperatur. De har därefter analyserats med antibody microarrays.
De experiment som har gjorts visar att aktiviteten varierar mellan antikroppar som producerats vid olika tillfällen. Detta kan för vissa antikroppar förklaras av att antikropparna av misstag har droppats i olika koncentrationer. Undersökningar av utvalda antikroppar har också visat att det har bildats olika typer av oligomerer i lösningarna, det vill säga att två eller flera antikroppar har bundit sig med varandra, men att detta sker på liknande sätt oavsett produktionstillfälle och därför inte förklarar aktivitetsskillnaderna. Därför behövs ytterligare experiment göras för att kartlägga exakta anledningar till skillnaderna. För de undersökta serumproverna indikerar resultaten att ingen av de olika sätten att hantera proven på påverkar pålitligheten hos antibody microarrays. I framtiden är det dock viktigt att undersöka påverkan för både friska och sjuka individer samt förmågan att skilja dessa grupper åt.

• author: Nordahl, Elin and Thörnqvist, Linnea
• supervisor: Anna Isinger Ekstrand; Christer Wingren
• organization: Department of Immunotechnology; Educational programmes, LTH
• course: KIM820 20171
• year: 2017
• type: H2 - Master's Degree (Two Years)
• subject: Technology and Engineering
• language: English
• id: 8913316
• date added to LUP: 2017-06-09 16:25:27
• date last changed: 2017-06-09 16:25:27