Phage Display to select IAPP-specific protein binders for amyloid kinetics inhibition

Abstract

Prefibrillar oligomers are thought to be the “culprit” behind the cytotoxicity of islet amyloid polypeptide (IAPP) to pancreatic islet β-cells. The oligomers are generated in the process of IAPP’s conformational change into amyloid fibrils. The depletion of islet β-cells has been connected to type II diabetes. Knowledge of how to stop IAPP from switching into the cytotoxic oligomer form is of the utmost importance. The microscopic process secondary nucleation has previously been identified as the reaction mechanism step responsible for the numerous production of these oligomers. Three large phage display libraries were analyzed to find fibril-specific protein binders that can inhibit secondary nucleation. Protein binders, specific against IAPP, were selected from phage display libraries during three rounds of selection. Fibril-specific binders were isolated from monomer-specific members with IAPP coupled to silica nanoparticles. The binders were ranked by their affinity using surface plasmon resonance. The protein binders with the highest affinity against IAPP were sequenced and afterwards produced in soluble form. These soluble proteins were analyzed to find members that can inhibit the fibril-catalyzed secondary nucleation reaction step during a kinetics analysis. Two scFv were found to inhibit both primary and secondary nucleation in a dual effect. This method had previously been used to find secondary nucleation inhibiting proteins for amyloid β peptide involved in Alzheimer’s disease. Based on these results, the method used in both these cases might be instrumental in developing protein inhibitors in other amyloidogenic protein diseases where toxic oligomers are responsible.

Abstract (Swedish)

Den bakomliggande orsaken till att islet amyloid polypeptide (IAPP) är cytotoxisk mot β-celler från bukspottkörteln tros vara prefibrillära oligomerer. Oligomererna skapas då IAPP ändrar konformation till amyloidfibriller. Förlusten av β-celler från cellklusterna har kopplats till typ II-diabetes. Ytterligare kunskap om hur man hindrar IAPP från att växla till den giftiga oligomerformen är oerhört betydelsefullt. En mikroskopisk process som kallas sekundärnukleering har tidigare identifierats som det reaktionsmekanismsteget som är ansvarigt att producera dessa oligomerer. För att försöka hitta fibrilspecifika proteinbindare som kan hämma sekundärnukleering, undersöktes tre stora fagdisplaybibliotek. Proteinbindare som var specifika mot IAPP, valdes ut från fagdisplaybiblioteken under tre urvalsrundor. Fibrilspecifika medlemmar separerades från monomerspecifika genom att koppla IAPP till kiseldioxidnanopartiklar. Ytplasmonresonans användes därefter för att rangordna proteinbindarna efter deras affinitet mot IAPP. Proteinbindarna med den högsta affiniteten mot IAPP, sekvenserades och framställdes sedan i löslig form. I en kinetisk analys så undersöktes dessa lösliga proteiner för att hitta medlemmar som kan hämma sekundärnukleering. Två scFv visade en dubbel effekt av att hämma både primär- och sekundärnukleering. Denna metod för att hitta proteinbindarna har tidigare använts för att hitta proteiner som kan hämma sekundärnukleering hos amyloid β-peptide, involverad i Alzheimers sjukdom. Eftersom metoden nu lyckats användas i båda dessa fall kan den vara avgörande för att utveckla proteinhämmare för andra amyloidrelaterade proteinsjukdomar där giftiga oligomerer är ansvariga.

Popular Abstract (Swedish)

IAPP är ett litet protein som utsöndras tillsammans med insulin i bukspottkörteln. Detta protein kan omvandla sig under felvikning och hopklumpning till en annan struktur som tros spela en avgörande roll i typ 2-diabetes. Den här studien har hittat två små proteiner som till synes kan hämma ett giftigt mellansteg i IAPP:s utveckling till denna struktur.
Typ 2-diabetes är en långsamt tickande bomb som kan leda till en för tidig död. Det blir alltmer förekommande i världen och inget botemedel finns än i sikte. Bakom diabetesgåtan är en misstänkt bov ett litet protein vid namn IAPP. IAPP kan i vissa fall ändra konformation och klumpa ihop sig i trådlika strukturer. Man kan tänka sig att denna struktur är uppbyggd av starka men böjliga biologiska byggklossar som stapplande ovanpå varandra. Varje kloss är ett IAPP protein som antagit denna konformation. På ytan av dessa trådar kan det växa ”oligomerer” som är ett mellansteg till nya trådar. Det är detta mellansteg som dödar de celler som producerar insulin och man tror därför dessa oligomerer ligger bakom utbredningen av typ 2-diabetes.
Den minsta beståndsdelen av oligomerer kan använda trådarnas yta som språngbräda för att växa som kulor på ett snöre till oligomerer. Detta snöre kan sen brytas av och ändra konfirmation till en ny tråd. Processen där oligomerer växer på trådarnas yta kallas sekundärnukleering och den vill man såklart hindra. Det finns därför ett behov av biologiska molekyler som kan fästa sig på trådarnas yta och hindra oligomererna från att växa. Ett av avhandlingens syfte var att hitta hämmare till dels de andra stegen som bildar trådarna men helst sekundärnukleering med en speciell metod.
Två antikroppsfragment hittades som verkar kunna hämma sekundärnukleering av i realtid växande IAPP i laboratoriemiljö. Dessa fragment hittades i ett urval av miljarder andra smått olika proteiner. Urvalsprocessen gick till så att IAPP fästes på små nanopartiklar. Sen ”kastade” man successivt alla miljarder proteiner på dem och ser vad som fortfarande fäster kvar på IAPP när man tvättat. De proteiner som binder till IAPP, odlas sedan i bakterier och visas på ytan av bakteriofager, små ofarliga viruspartiklar, i en metod som kallas ”fagdisplay” Denna metod har tidigare hittat proteiner som hämmar sekundärnukleering av ett annat protein som är involverad i Alzheimers.
Denna metod har fungerat för att hitta proteinbindare som hämmar sekundärnukleering av två olika proteiner och att visa detta var ett annat av avhandlingens syfte. Därför finns det stora chanser att den kan användas för att hitta proteinhämmare i andra sjukdomar där dessa oligomerer är ansvariga. Forskningen i denna avhandling kan potentiellt hjälpa med att öka förståelsen av mekanismen inom produktionen av dessa oligomerer. Genom att studera proteinbindare som är framtagna med denna metod kan man kanske få idéer om hur man ska designa ett potentiellt diabetesbotemedel.

• author: Berndtson Klette, Gustav
• supervisor: Sara Linse; Martin Lundqvist
• organization: Biophysical Chemistry
• alternative title: Fagdisplay för att välja IAPP-specifika proteinbindare för amyloidkinetik hämning
• course: KFKM05 20201
• year: 2020
• type: H2 - Master's Degree (Two Years)
• subject: Technology and Engineering; Chemistry
• keywords: Diabetes, Phage Display, Antibody, IAPP, S100G, Amyloid fibril formation, Inhibitor, Drug development, Biophysical chemistry, Biofysikalisk kemi
• language: English
• id: 9033305
• date added to LUP: 2021-01-19 08:13:34
• date last changed: 2021-01-19 08:13:34