Diffusion and Camera-Noise Modelling for Analysis of Single-Particle Tracking Movies

Abstract

Interactions between T-cells and other body cells is an essential part of the immune system. It involves the binding between surface receptors of the two cells. Specifically, T-cell receptors (TCRs) bind onto pMHC (peptide-loaded major histocompatibility complex) molecules on the partnering cell surface. This way, a cell signal from the TCR to the nucleus can be initiated. Depending on the "message" of the signal, cells may respond in various ways. While it has been found that the signal message is dependent on how, where and when the signalling occurs, the interaction details and kinetics remain largely unclear. A specific observable that has been found experimentally is the average time duration of a binding event, called the "lifetime" of the interaction.

To measure biophysical parameters in practise, e.g. diffusion constants or lifetimes, is not as straightforward as it may appear. In here, we consider an experimental setup which utilises fluorescence microscopy in a controlled environment. The TCRs are allowed to move on a supported lipid bilayer (mimicking a real cell membrane) and have been labelled with a fluorescent dye. The partnering pMHCs are free to move on the surfaces of live T-cells. As such, the motion of these proteins is effectively two-dimensional and the resultant pMHC trajectories can be imaged with a fluorescence microscopy setup with a suitable camera.

After tracking the particles in a tracking program, we are left with data in the form of single-particle tracks. At this point, most conventional methods start by trying to estimate the diffusion constants (corresponding to free or bound TCR, respectively). For instance, this can be done with a usual mean-square-displacement analysis. Despite the importance of this data analysis step, many of its difficulties are often overlooked. These include systematic bias, such as tracking errors in the form of dot detection and dot linking. Moreover, there are uncharted errors involved in the analysis procedures and it is hard to assess the reliability and associated errors of estimated parameters.

In this study, we assess the ability of analysis methods for estimating diffusion constants and the fraction of steps spent in a free versus a bound state. To be able to estimate the errors on parameter estimates and potential biases in these, we analyse tracking data from synthetic movies. To this end, we include the diffusive motion, binding as well as photon statistics and camera-induced noise in the imaging system. As a benefit, the synthetic movies allow us to test and assess less conventional analysis methods on the data. In particular, we test a hidden Markov model analysis scheme and systematically compare it to a step-size distribution analysis. Furthermore, reliable simulated results could help us mitigate the uncertainty involved in the analyses by indicating sound experimental modifications. This can be done by calibrating all simulation parameters to agree with experiments, such that whatever errors and biases we obtain when analysing synthetic movies, will correspond well to those obtained with experimental movies.

Popular Abstract (Swedish)

I samband med att vi människor bor allt tätare och träffas allt oftare, ökar tyvärr även spridningen av virus. Det som tidigare i historien var en epidemi, blir nu snabbt en pandemi (t.ex. coronapandemin med start 2020). Mot denna bakgrund står det klart att vårt immunförsvar spelar en avgörande roll för vår hälsa och i sin tur samhällets funktion. Vår bästa metod är som bekant att träna upp vårt immunförsvar mot en specifik inkräktare, t.ex. ett virus, genom att vaccinera oss. Att läran om immunförsvaret är mer relevant än någonsin är därför ingen överdrift.

Men för att t.ex. kunna producera ett effektivt vaccin, behöver vi förstå hur vårt immunsystem fungerar. I synnerhet behöver immunsystemets celler kunna kommunicera med varandra. För det ändamålet har cellerna receptorer fästa på sina utsidor; informationsöverföringen sker genom att en sådan receptor från den ena cellen kemiskt binder till en motsvarande receptor på den andra cellen. Receptorerna är proteinkomplex som sträcker sig ner mot cellkärnan.

Denna typ av bindning är dock svår att studera, till följd av den mikroskopiska längdskalan och proteinernas komplexa former. Två relevanta storheter i sammanhanget är hur snabbt proteinerna rör sig i fritt och bundet tillstånd, och hur ofta ett protein byter mellan dessa tillstånd. Även tidsintervallet då proteinerna är bundna till varandra, kallad deras livstid, är viktigt för att förstå bindningarna. I artikeln [J. J. Y. Lin. et al, “Mapping the stochastic sequence of
individual ligand-receptor binding events to cellular activation: T cells act on the rare events”. I: Science Signaling 12.564 (2019)] visas att det är interaktionerna med ovanligt långa livstider som T-cellen reagerar på.

För att kringgå svårigheterna med att studera enskilda bindningar i detalj, studerar Peter Jönsson m.fl. vid fysikalisk kemi på kemicentrum vid Lunds universitet händelserna ur ett statistiskt perspektiv. De imiterar den ena celltypens cellmembran, på vilken de fäster många ytproteiner. Dessa proteiner har färgats in med ett självlysande ämne, sådant att de syns i en mörk omgivning. På så vis kan Jönssons grupp filma proteinernas tvådimensionella rörelser genom ett mikroskop. Idén bakom detta är att proteinerna bör röra sig mindre i bundet tillstånd, vilket syns om man analyserar filmen genom att spåra enskilda proteiner.

Vilken sorts rörelse uppvisar egentligen proteinerna i en stilla, enformig vattenmiljö (utan några bindningar)? Då vattnet har en viss värme, rör sig faktiskt vattnets molekyler sett på en mikroskopisk längdskala. Denna rörelse leder i sin tur, via massor av krockar, till en observerad slumpmässig rörelse - diffusion - hos proteinerna. Diffunderingen är fullständigt oregelbunden, till synes likt en flygdrakes rörelser under snabbt varierande vindar. Utmaningen är att urskilja effekten av bindningen från denna slumpmässiga rörelse.

Att identifiera de bundna komplexen från att de diffunderar långsammare än de fria proteinerna försvåras av de många fler större stegen, tillsammans med diverse brus (t.ex. från kameran) som ingår i mätningarna. Mot den bakgrunden går projektet i denna uppsats ut på att undersöka förutsättningarna för att bestämma diffusionskonstanterna, sannolikheterna för att byta tillstånd och livstiden. Detta görs genom att simulera hela experimentet på en dator, för att sist analysera denna data med olika statistiska metoder. För detta behövs modeller av proteinernas rörelser och bindningar, mikroskopet och kameran som används i experimentet. Att simulera förloppet har nämligen fördelen att all relevant information är känd, exempelvis proteinernas positioner vid varje tidpunkt.

• author: Clarkson, Erik
• supervisor: Tobias Ambjörnsson
• organization: Computational Biology and Biological Physics - Undergoing reorganization
• course: FYTM04 20221
• year: 2022
• type: H2 - Master's Degree (Two Years)
• subject: Physics and Astronomy
• keywords: reaction-diffusion, camera-noise modelling, single-particle tracking, Gillespie simulations
• language: English
• id: 9098882
• date added to LUP: 2022-09-05 10:38:26
• date last changed: 2022-09-05 10:38:26