Skip to main content

LUP Student Papers

LUND UNIVERSITY LIBRARIES

Optimization of Recombinant Phytoglobin Production

Rollén, Emelie LU and Bergström Gombrii, Hanna LU (2025) KBKM05 20251
Pure and Applied Biochemistry
Abstract
Hemoglobins, part of the globin superfamily, are heme-containing proteins that are involved in numerous biological processes, primarily oxygen transport. In plants, they are known as phytoglobins and serve diverse roles beyond oxygen transportation, with potential applications as artificial blood substitutes, iron supplements, and plant-based meat alternatives. A class 1 phytoglobin from sugar beet Beta vulgaris (BvPgb 1.2) has emerged as a promising candidate for such uses, but efficient recombinant expression remains a challenge. In this master’s thesis, both BvPgb 1.2 rWT and alanine substituted mutant C86A were expressed in E. coli BL21(DE3) and purified through QFF and BHP using an ÄKTATM Avant system. The project aimed to optimize... (More)
Hemoglobins, part of the globin superfamily, are heme-containing proteins that are involved in numerous biological processes, primarily oxygen transport. In plants, they are known as phytoglobins and serve diverse roles beyond oxygen transportation, with potential applications as artificial blood substitutes, iron supplements, and plant-based meat alternatives. A class 1 phytoglobin from sugar beet Beta vulgaris (BvPgb 1.2) has emerged as a promising candidate for such uses, but efficient recombinant expression remains a challenge. In this master’s thesis, both BvPgb 1.2 rWT and alanine substituted mutant C86A were expressed in E. coli BL21(DE3) and purified through QFF and BHP using an ÄKTATM Avant system. The project aimed to optimize the expression and purification of BvPgb 1.2, with the additional objective of evaluating whether expression analysis can serve as a viable method for optimizing protein cultivation protocols. δ-ALA and IPTG levels were varied, and expression levels were evaluated using RT-qPCR and complemented by an ocular assessment of the protein’s red pigmentation. RT-qPCR results showed that IPTG induced upregulation in BvPgb 1.2 at both IPTG concentrations, with a greater fold change observed at the lower IPTG concentration. Expression of the investigated heme synthesis gene (hemH) varied slightly between conditions, indicating the need for further investigation. Both the RT-qPCR and ocular assessment pointed to the same optimal conditions with an upregulation (236-fold) of the BvPgb 1.2 gene and upregulation (1.4-fold) of the hemH gene. Additionally, further research is needed to determine which protocol most effectively optimizes the expression of BvPgb 1.2. (Less)
Popular Abstract (Swedish)
Ett protein med potential: så kan växternas hemoglobin förändra världen

Från blodbrist till vegetarisk kost uppmanas vetenskapen ständigt att hitta lösningar som främjar både hälsa och hållbarhet. En spännande möjlighet finns i phytoglobiner; växternas egna form av hemoglobin. I det här projektet har ett phytoglobin från sockerbeta producerats och optimerats i bakterier, med målet att ta fram ett effektivt sätt att framställa detta lovande protein.

I dagens samhälle står vi inför en rad utmaningar inom medicin, mat och hållbarhet. Blodbrist är ett stort problem i många delar av världen, särskilt i akuta situationer där behovet av blodtransfusioner är stort men tillgången ofta är begränsad och logistiken komplicerad. Samtidigt finns... (More)
Ett protein med potential: så kan växternas hemoglobin förändra världen

Från blodbrist till vegetarisk kost uppmanas vetenskapen ständigt att hitta lösningar som främjar både hälsa och hållbarhet. En spännande möjlighet finns i phytoglobiner; växternas egna form av hemoglobin. I det här projektet har ett phytoglobin från sockerbeta producerats och optimerats i bakterier, med målet att ta fram ett effektivt sätt att framställa detta lovande protein.

I dagens samhälle står vi inför en rad utmaningar inom medicin, mat och hållbarhet. Blodbrist är ett stort problem i många delar av världen, särskilt i akuta situationer där behovet av blodtransfusioner är stort men tillgången ofta är begränsad och logistiken komplicerad. Samtidigt finns ett stort behov av förbättrade metoder för att bevara organ inför transplantation eftersom många organ går förlorade varje år på grund av tidsbegränsningar och kvalitetsproblem.

Ett annat utbrett hälsoproblem är järnbrist, framförallt bland kvinnor och barn; ett tillstånd som orsakar bland annat trötthet och orkeslöshet. Järntabletter är den vanligaste behandlingen, men eftersom många upplever biverkningar som magbesvär behövs nya och skonsammare sätt att tillföra kroppen järn. Samtidigt ökar intresset för växtbaserade köttalternativ, både för att möta en ökande efterfrågan på näringsrika produkter och för att minska miljöpåverkan från animaliska produkter.

Redan 1939 upptäcktes phytoglobiner; hemoglobinliknande proteiner i växter. Dessa proteiner kan bland annat binda syre och innehåller järn, vilket gör dem intressanta både som potentiella blodsubstitut och som näringskälla. Men för att kunna använda phytoglobiner behövs fungerande odlingsprotokoll där mycket och rent protein produceras. Det här projektet syftade därför till att optimera produktionen av ett phytoglobin från sockerbeta i en annan värd, så kallad rekombinant produktion. Som värdorganism användes bakterien E. coli för att möjliggöra storskalig proteinproduktion. Därefter renades proteinet upp för vidare studier, med fokus på att undersöka proteinmängd, funktion och renhet.

Målet med projektet var att hitta de bästa odlingsförhållandena för att producera så mycket fungerande protein som möjligt. Mängden av två viktiga tillsatser varierades i odlingsmediet, IPTG, som startar produktionen av proteinet, och δ-ALA, som är en byggsten i produktionen av den viktiga hemgruppen i proteinet.

För att utvärdera odlingsförhållandena användes RT-qPCR, en metod som mäter hur mycket en viss gen uttrycks. Dessutom utvärderades proteinet visuellt genom cellernas röda färg, vilken är karaktäristisk för hemproteiner. Båda metoderna pekade på samma odlingsförhållanden som mest gynnsamma för proteinproduktionen, och dessa användes därför i det optimerade protokollet.

Resultaten visade att både det ursprungliga och det optimerade protokollet producerade fungerande protein, men med olika renhet. Det optimerade protokollet gav ett renare protein, vilket tyder på att tillvägagångssättet är lämpligt för framtida användning. Samtidigt krävs mer arbete för att avgöra vilket protokoll som är mest effektivt sett till producerad mängd protein. (Less)
Please use this url to cite or link to this publication:
author
Rollén, Emelie LU and Bergström Gombrii, Hanna LU
supervisor
organization
course
KBKM05 20251
year
type
H2 - Master's Degree (Two Years)
subject
keywords
applied biochemistry, BvPgb 1.2, phytoglobin, δ-ALA, IPTG, qPCR, E. coli, optimization, protein production, heme
language
English
id
9198619
date added to LUP
2025-09-17 15:23:58
date last changed
2025-09-17 15:23:58
@misc{9198619,
  abstract     = {{Hemoglobins, part of the globin superfamily, are heme-containing proteins that are involved in numerous biological processes, primarily oxygen transport. In plants, they are known as phytoglobins and serve diverse roles beyond oxygen transportation, with potential applications as artificial blood substitutes, iron supplements, and plant-based meat alternatives. A class 1 phytoglobin from sugar beet Beta vulgaris (BvPgb 1.2) has emerged as a promising candidate for such uses, but efficient recombinant expression remains a challenge. In this master’s thesis, both BvPgb 1.2 rWT and alanine substituted mutant C86A were expressed in E. coli BL21(DE3) and purified through QFF and BHP using an ÄKTATM Avant system. The project aimed to optimize the expression and purification of BvPgb 1.2, with the additional objective of evaluating whether expression analysis can serve as a viable method for optimizing protein cultivation protocols. δ-ALA and IPTG levels were varied, and expression levels were evaluated using RT-qPCR and complemented by an ocular assessment of the protein’s red pigmentation. RT-qPCR results showed that IPTG induced upregulation in BvPgb 1.2 at both IPTG concentrations, with a greater fold change observed at the lower IPTG concentration. Expression of the investigated heme synthesis gene (hemH) varied slightly between conditions, indicating the need for further investigation. Both the RT-qPCR and ocular assessment pointed to the same optimal conditions with an upregulation (236-fold) of the BvPgb 1.2 gene and upregulation (1.4-fold) of the hemH gene. Additionally, further research is needed to determine which protocol most effectively optimizes the expression of BvPgb 1.2.}},
  author       = {{Rollén, Emelie and Bergström Gombrii, Hanna}},
  language     = {{eng}},
  note         = {{Student Paper}},
  title        = {{Optimization of Recombinant Phytoglobin Production}},
  year         = {{2025}},
}