Mechanisms of Transgene Silencing in Neural Cells -Implications for Ex Vivo Gene Therapy to the Brain

Abstract

The use of genetically modifi ed neural stem and progenitor cells could possibly be a future strategy for repairing a brain suffering from neurodegeneration. However, so far it has proven diffi cult to maintain sufficient levels of a transferred gene in suitable cell types, after transplantation. In the present thesis I studied the silencing of transgenes induced upon differentiation of neural progenitor cell lines when grafted to the adult rat CNS. The silencing could be induced in vitro by initiating differentiation and this silencing followed the same temporal pattern as detected upon grafting. In this in vitro model, mechanisms important for transgene silencing in these cells could be studied and we found that inhibition of histone deacetylation could reactivate transgene expression. However, when analyzing the actual level of histone acetylation, the levels were not different in differentiated cells compared to levels detected in proliferating cells. This indicates although histone deacetylase inhibitors could boost transgene expression, this mechanism is not the major player in the silencing induced by differentiation. In the proliferating state transgene expression was stable but did variegate in the cells. The transgene expression did not refl ect proviral content, but was correlated to the level of histone3-acetylation. This suggests that positional effects regulate transgene activity. Although inhibition of histone deacetylation dramatically increased transgene expression and the expression was tightly correlated to histone3- acetylation, the inhibition could not override the positional effects. Data in this thesis propose that DNA methylation could be one of the mechanisms mediating a more static repression in these cells. By fl anking the transgene by insulator sequences, known to form boundaries in chromatin protecting sequences from condensation we detected a partial prevention of transgene silencing both after in vitro and in vivo differentiation. This prevention was also detected by inhibiting histone deacetylation and DNA methylation, prior to grafting. In vivo, cells exhibiting immature morphology were mainly affected whereas differentiated cells were rarely found to express the transgene. Further indicating other mechanisms to be important for the silencing taking place upon differentiation.

Abstract (Swedish)

Popular Abstract in Swedish

Ett nytt och experimentellt sätt att bota eller lindra sjukdomssymptom är att, istället för att tillföra en medicin, rätta till felet på en genetisk nivå. Detta kan åstadkommas genom att överföra nya, fungerande gener, sk transgener, till celler som då börjar producera protein, som i sin tur kan ge upphov till en terapeutisk effekt. I hjärnan skulle denna typ av behandling kunna ge en lokal frisättning av tex tillväxtfaktorer, som har visats kunna skydda nervceller från att dö vid neurodegenerativa sjukdomar. Det fi nns två olika sätt att överföra gener till hjärnan: Antingen tillsätts genen direkt till hjärnans celler (in vivo genterapi) tex med hjälp av virus, eller också modifi eras celler genetiskt i kultur för att sedan transplanteras till önskat område (ex vivo genterapi). Det finns fördelar och nackdelar med båda metoderna. In vivo genterapi, har visat sig ge långvariga och höga nivåer av det önskade proteinet. Problemet med denna metod är att det är svårt att kontrollera vilka celler som den nya genen överförs till, hur många kopior av genen som integrerar i cellens genom och var i genomet de hamnar. Detta har visat sig kunna ge allvarliga konsekvenser. Ex vivo genterapi har däremot fördelen att man kan kontrollera för dessa faktorer innan cellerna transplanteras till hjärnan. Denna metod ger också en möjlighet att eventuellt kunna ersätta celler som dött pga neurodegenerativ sjukdom eller stroke.



I min avhandling har jag främst studerat det största problemet med ex vivo genterapi: att genuttrycket nedregleras när celler transplanteras till hjärnan. Jag har studerat transgenuttryck i genetiskt modifi erade celler, som tidigare visat sig vara lämpade för transplantation till just hjärnan, i kultur under olika förhållanden samt efter transplantation till hjärnan på råttor. Jag har kunnat visa att transgener, precis som vid transplantation, nedregleras om odlingsförhållandena ändras till att efterlikna miljön i hjärnan. Detta sker i takt med att cellen slutar dela sig och börjar uppvisa en mer mogen neural karaktär (differentiering). Detta har gett mig möjlighet att in vitro studera mekanismerna som ligger bakom nedregleringen. Bland annat har jag, med hjälp av inhibitorer, kunnat visa att mekanismer som ligger bakom kondensering av kromatin är viktiga för nedreglering av transgenuttryck. Dessa mekanismer är bland annat modifi eringar av de proteiner som organiserar cellens DNA, histonprotein, och jag har i detalj studerat vissa av dessa modifi kationer i de överförda transgenerna. Jag har kunnat visa att det fi nns ett samband mellan en typ av histonmodifi ering (adderandet av acetylgrupper på histon3) och transgenuttryck i delande celler. För även i celler som delar sig har vi detekterat att transgener inte uttrycks i lika stor omfattning från olika integrerade kopior. Den kraftiga nedregleringen som sker vid diffrentiering verkar däremot inte höra ihop med just de histonmodifi eringar jag har studera. Jag försökte även att förhindra nedregleringen av transgenen vid differentiering genom att hämma kromatinkondensering före transplantation, alternativt genom att omgärda transgenen med sk insulatorer. Insulatorer är små DNA-sekvenser, som i tidigare studier visat sig kunna hämma spridning av kromatinkondensering och härmed skydda mot nedreglering. Båda sätten visade sig ha en detekterbar effekt, men främst på celler som inte hade differentierat ut till mogna neurala celler. Det visar återigen att de mekanismer vi har undersökt inte helt och hållet kan förklara den problematiska nedregleringen av transgener man ser vid transplantation, men resultaten i denna avhandling har ändå gett oss ökad vetskap om de bakomliggande orsakerna. Detta kommer förhoppningsvis kunna resultera i en framtida fungerande ex vivo genterapi.

• author: Rosenqvist, Nina
• supervisor: Cecilia Lundberg
• opponent: Prof. Arenas, Ernest, Laboratory of Molecular Neurobiology, Department of Medical Biochemistry and Biophysics, Karolinska
• organization: Neurobiology (research group)
• publishing date: 2005
• type: Thesis
• publication status: published
• subject: Neurosciences
• keywords: neurophysiology, Neurologi, Neurology, neuropsychology, ChIP, rat, transgene, insulator, differentiation, GFP, lentivirus, DNA methylation, histone deacetylation, chromatin, expression, silencing, stem cell, progenitor, gene therapy, neurofysiologi, neuropsykologi, CNS, transplantation
• pages: 116 pages
• defense location: Segerfalksalen, Wallenberg Neuroscience Center
• defense date: 2005-01-21 13:00:00
• ISBN: 91-628-6392-4
• language: English
• LU publication?: yes
• additional info: Nina Rosenqvist, Caroline Hård af Segerstad, Christofer Samuelsson, Jens Johansen and Cecilia Lundberg. 2002. Activation of silenced transgene expression in neural precursor cell lines by inhibitors of histone deacetylation J Gene Med., vol 4 pp 248-57. J Gene Med.; Nina Rosenqvist, Johan Jakobsson and Cecilia Lundberg. . Inhibition of chromatin condensation prevents transgene silencing in a neural progenitor cell line transplanted to the rat brain Cell Transplantation (accepted); Johan Jakobsson, Nina Rosenqvist, Lachlan Thompson, Perrine Barraud and Cecilia Lundberg. 2004. Dynamics of transgene expression in a neural stem cell line transduced with lentiviral vectors incorporating the cHS4 insulator Exp Cell Res., vol 298 pp 611-23. Exp Cell Res.; Nina Rosenqvist, Johan Jakobsson, Troels Tolstrup-Nielsen and Cecilia Lundberg. . Changes of Histone Acetylation Levels in a Lentiviral Vector in Dividing and Differentiated Neural Cells Dept of Neurobiology, LU (submitted)
• id: 06020fc4-a58b-4ffd-a16e-c077ec828e36 (old id 544148)
• date added to LUP: 2016-04-04 11:11:24
• date last changed: 2018-11-21 21:03:14