Novel findings on cellular trafficking and targeting for granule storage of neutrophil elastase, a multifunctional effector molecule of innate immunity

Abstract

Neutrophil elastase (NE) has important roles in innate immunity, killing pathogens and controlling the immune response; but how NE is targeted to developing granules is not understood. Therefore, the aim of this thesis was to investigate the sorting of NE.



Transfection experiments in a leukemic cell line, which were confirmed in normal hematopoietic cells, showed that a population of proNE was targeted to the plasma membrane and endocytosed. This targeting required an intact carboxy-terminal propeptide. Furthermore, modified proNE was not endocytosed, indicating structural requirements for endocytosis.



An association was demonstrated between the tetraspanin CD63 and proNE upon coexpression in COS cells. Furthermore, depletion of CD63 in a promyelocytic cell line (achieved by RNA interference or a CD63 mutant) caused reduced processing of proNE into mature NE and reduced constitutive secretion of proNE. We therefore propose that CD63 may be a transmembrane linker that facilitates granule targeting of proNE.



Results from a monocytic cell line indicated that the sorting of proNE was a multistage process including trafficking to the cell surface, endocytosis through coated vesicles and possibly lipid rafts, and possible conversion to mature NE in late endosomes. The inhibition of proNE’s activation into mature NE was accompanied by the accumulation of proNE, suggesting a requirement for activation before granule targeting.



This research provided new perspectives on the cellular trafficking of NE. The thesis proposes that granule sorting of proNE is facilitated by a tetraspanin protein serving as a transmembrane linker and transporter. The hypothesis needs further testing in primary cells to acquire additional evidence of the interactions involved.

Abstract (Swedish)

Popular Abstract in Swedish

Kroppens immunförsvar brukar delas in i det medfödda och det adaptiva

immunförsvaret. Det medfödda immunförsvaret reagerar snabbt på yttre hot såsom

bakterier. Olika sorters vita blodkroppar är väldigt viktiga för detta snabba svar på

infektion och i min avhandling har jag koncentrerat mig på en av dessa; neutrofilen.



Neutrofilen är den vita blodkropp som först kommer fram till en infektion. Den

lockas, av olika substanser, att stanna upp och fästa ordentligt till blodkärlet och

krypa ut mellan cellerna som utgör kärlväggen. Därifrån kryper den vidare ut i

vävnaden tills den får kontakt med de invaderande bakterierna. För att döda

bakterierna äter neutrofilerna helt enkelt upp dem och innesluter dem i en

membranblåsa kallad fagosom. In i denna membranblåsa levererar neutrofilen sedan

olika ämnen som är giftiga för bakterien och bryter ner den, och bekämpar på detta

vis infektionen. Samtidigt skickar neutrofilen ut andra ämnen i omgivningen för att

locka till sig fler neutrofiler såväl som andra sorters vita blodkroppar. Dessa behövs

för att bekämpa infektionen och så småningom städa upp när bakterierna väl har

dödats.



Neutrofiler är väldigt kortlivade celler och för att snabbt kunna reagera på bakterier

har de redan producerat och lagrat upp alla giftiga ämnen som behövs. Dessa

tillverkas under tiden neutrofilerna mognar fram i benmärgen och lagras upp i små

blåsor kallade granula. Neutrofiler har flera sorters granula som lagrar olika protein

med olika uppgifter. Denna avhandling rör ämnen i den första sortens granula som

produceras; de primära.



Det finns många olika ämnen med olika uppgifter i primära granula och jag har

koncentrerat mig på neutrofilt elastase (NE). NE kan bryta ner ytterväggen i vissa

bakterier och är därför viktigt för bakterie-bekämpning. Dessutom är NE som släpps

ut utanför cellen viktig för signalering till andra vita blodkroppar. En för stor mängd

utanför cellen kan dock leda till skador på omgivande vävnad. I vissa sällsynta

sjukdomar är NE muterat, vilket, av en okänd anledning, kan leda till att neutrofiler

helt eller delvis saknas i kroppen. En brist på neutrofiler ger upphov till stor

känslighet för infektioner vilket i förlängningen kan leda till döden. Sjukdomar som

kännetecknas av brist på neutrofiler kan också uppstå när andra protein är muterade,

som verkar behövas för korrekt transport av NE. När protein tillverkas i cellen

behövs nämligen olika medhjälpare för att transportera (i det här fallet) NE från



tillverkningsplatsen till upplagringsplatsen i granula. Denna transportväg var inte

klarlagd för NE, vilket inte heller alla medhjälpare var. Därför inriktade jag min

forskning på att kartlägga transportvägen och medhjälpare.



I mitt första arbete (I) upptäckte vi att NE kan transporteras till ytan av celler och

sedan tas upp inuti cellen igen, vilket inte var känt tidigare. Transport till ytan var

beroende av att NE var intakt. I mitt andra arbete (II) undersökte vi återupptaget

från cellytan närmare. När vi jämförde normalt NE med en mutant vi framställt fann

vi att enbart normalt NE kunde tas upp av cellen, vilket innebär att cellen har krav på

vad som får transporteras in.



I mitt tredje arbete (III) undersökte vi en eventuell medhjälpare, det

membrangenomträngande proteinet CD63, för en roll i NE-transporten till

upplagringsplatsen. Vår hypotes var att NE behövde ett protein som fungerade som

en länk för indirekt kontakt med olika medhjälpare för transport. Vi fann att NE

kunde interagera med CD63. Vidare tryckte vi ner mängden CD63 för att undersöka

hur NE–transporten fungerade när CD63 saknades. Vi fann då att NE inte tog sig

från tillverkningsplatsen i cellen, utan fastnade där. Inget NE transporterades korrekt

till granula utan hjälp av CD63.



I mitt sista arbete (IV) undersökte vi transportvägarna av NE och en nära släkting,

PR3, i cellen. Vi fann att transporten sker i flera steg.



Sammantaget har mitt arbete gett nya insikter om transporten av NE i cellen och en

möjlig medhjälpare för korrekt transport, CD63, har identifierats. Detta kan ha

betydelse för förståelse av sjukdomar där transporten av NE är störd och för

förståelse av protein-transport i neutrofiler i allmänhet. I förlängningen hoppas vi att

kunskapen om denna transport ska kunna användas till att manipulera neutrofiler att

lagra upp olika läkemedelssubstanser för att sedan släppa dem på rätt plats i kroppen.

Detta scenario skulle vara användbart vid olika inflammatoriska sjukdomar.

• author: Källquist, Linda
• supervisor: Markus Hansson; Inge Olsson; Hans Tapper
• opponent: Professor Borregaard, Niels, Department of Hematology, Rigshospitalet, Copenhagen, Denmark
• organization: Division of Hematology and Transfusion Medicine; Hematology-lup-obsolete (research group)
• publishing date: 2009
• type: Thesis
• publication status: published
• subject: Hematology
• keywords: Hematopoietic cell, CD63, neutrophil elastase, targeting, trafficking, intracellular sorting, neutrophil, azurophil granule
• in: Lund University Faculty of Medicine Doctoral Dissertation Series
• volume: 2009:27
• pages: 163 pages
• defense location: Segerfalksalen, Wallenberg Neurocentrum, BMC, Sölvegatan 17, Lund
• defense date: 2009-03-27 13:00:00
• ISSN: 1652-8220
• ISBN: 978-91-86253-14-1
• language: English
• LU publication?: yes
• additional info: Tapper H, Källquist L, Johnsson E, Persson AM, Hansson M, and Olsson I. Neutrophil elastase sorting involves plasma membrane trafficking requiring the C-terminal propeptide. Exp Cell Res 312:3471-84, 2006. *Rosén H, *Källquist L, Hansson M, Olsson I. Neutrophil pro-elastase sorting involving the plasma membrane is structure dependent. Manuscript. *equal contribution Källquist L, Hansson M, Persson AM, Janssen H, Calafat J, Tapper H, Olsson I. The tetraspanin CD63 is involved in granule targeting of neutrophil elastase. Blood 112:3444-3454, 2008. Källquist L, Hansson M, Calafat J, Persson AM, Olsson I. Neutrophil elastase and proteinase 3 trafficking routes in myelomonocytic cells. Submitted for publication.
• id: 075eb4b9-4afe-4dfa-8c99-2af056ca52d4 (old id 1304217)
• date added to LUP: 2016-04-01 13:35:59
• date last changed: 2019-05-21 21:01:51