The G protein-coupled receptor GPR30 signalosome - A novel G protein-independent mechanism regulating cAMP signaling and receptor trafficking

Abstract

The large protein family called G Protein-coupled receptors (GPCRs) has co-evolved with life throughout evolution; from single cell organisms all the way to complex beings such as us humans. The fact that GPCRs are involved in essentially every physiological event, and that ~50% of drugs on the current market are either directly or indirectly targeted towards the function of GPCRs, we can be certain of their considerable importance.

This thesis is dedicated solely to one particular GPCR, GPR30. This receptor is shrouded in uncertainty with contradictory results and opposing views on effectors and subcellular localization. The aim of this thesis was to elucidate the signaling and membrane trafficking of GPR30 in addition to look for any binding partners.

My primary findings were:

(1) GPR30 constitutively internalizes without any need for ligand binding.

(2) GPR30 associates with cytokeratin filaments

(3) GPR30 expression in ER+ breast cancer is a favorable prognostic marker for distant-disease-free survival.

(4) GPR30 confer some constitutive pro-apoptotic signaling but also readily sensitizes the cells to other

apoptotic stimuli.

(5) GPR30 directly associates with RAMP3 in-vivo and in-vitro and RAMP3 expression has an impact on

GPR30 subcellular localization in the murine heart.

(6) GPR30 constitutively form a signalosome with Membrane associated guanylate kinase proteins

(MAGUKs) and A Kinase Anchoring Protein 5 (AKAP5) through its C-terminal PDZ-motif. PKA-RII, which directly binds to AKAP5, is responsible for the attenuation of cAMP in response to cAMP- elevating agents.

Abstract (Swedish)

Popular Abstract in Swedish

Den här avhandlingen handlar om ett protein, en receptor, kallad GPR30. GPR30 tillhör proteinfamiljen G protein-kopplade receptorer vilka är nödvändiga för att celler ska kunna kommunicera med varandra och med sin omgivning. Förenklat sätt kan de ses sitta på ytan av en cell där de väntar på att någonting ska binda till dem, vilket aktiverar receptorerna och får dem att börja signalera. Vad för slags signal det blir i slutändan handlar om vad för slags cell det är, vilken typ av GPCR som aktiveras och av vad för stimuli. Ytterligare faktorer som spelar in är vilka varianter av G- proteiner som finns associerade med receptorerna. Beroende på vilka, så sätter de igång olika signalkaskader som kan få vitt olika konsekvenser.

Förutom att plötsligt aktiveras av att någonting binder till en GPCR så har det på senare år visat sig att de flesta GPCRer har en inneboende egenaktivitet, d.v.s. istället för att se på en receptor som en lampknapp så bör man se på den som en halvt påslagen dimmer. Hur pass uppvriden dimmern är, det beror på vilken GPCR man pratar om, men den går att vrida åt båda hållen. Detta är vad man utnyttjar när man utvecklar läkemedel som är riktade mot GPCRer, antingen vill man stänga av deras egenaktivitet, eller så vill man öka den.

I artikel 1 så visar jag att GPR30 har en omfattande konstitutiv internalisering av receptorn (d.v.s. ett ständigt flöde av GPR30 från ytan inåt i cellen) samt att den kan interagera med cytokeratiner, strukturella proteiner som bl.a. ger cellen stadga. Internalisering av GPCRer är generellt något som händer efter aktivering utav en receptor, så inflödet av receptorer kan tolkas som att GPR30 signalerar kontinuerligt (frågan är bara hur), utan krav på bindning av ligand.

I artikel 2 så tittar vi på mängden GPR30 i bröstcancervävnad och försöker hitta samband mellan uttrycksnivå och överlevnad. Vi fann att GPR30 är en oberoende prognostisk markör för god överlevnad hos patienter med bröstcancer som uttrycker den klassiska östrogen-receptorn ERα. Förutom den kliniska utvärderingen så undersökte jag även om GPR30 möjligen medför programmerad celldöd (apoptos), något som låter hemskt men är önskvärt vid cancer. En cancerforskares våta dröm är nämligen att cancerceller skall gå i apoptos medan normala celler inte skall påverkas. Vad jag såg var att celler som överuttryckte receptorn hade en lägre viabilitet, hade en rundare morfologi samt visade tecken på proapoptotiska signaler. Samma slutsats kunde dras när jag upprepade försöken i mer kliniskt relevanta bröstcancer-cellinjer.

I artikel 3 så visar vi för första gången på en interaktion mellan en typ 1 GPCR (GPR30) och Receptor Activity Modifying Protein 3 (RAMP3). Det var en transnationell studie som vi genomförde med Dr Caron från University of North Carolina, Chapel Hill, USA. Med hjälp av diverse tekniker och djurstudier kunde vi påvisa att proteinerna interagerar direkt med varandra och att RAMP3 verkar styra membranlokaliseringen av GPR30 i hjärtat. Dessutom har detta en kardioprotektiv effekt.

I artikel 4 som gav oss de största och mest omfattande resultaten för den här avhandlingen presenterar jag en rad nyheter. Efter ytterligare letande efter konstitutiva signaler så hittade jag av en slump att celler som uttrycker GPR30 har ett dämpat svar i en av de stora signaleringsvägarna, cAMP, som används i alla celler hela tiden kontinuerligt. Aktiviteten av denna signalväg mäts oftast i mängden cykliskt adenosinmonofosfat (cAMP) inne i cellerna. Jag tillverkade en receptormutant som saknade de fyra sista aminosyrorna i svansen på receptorn då vi trodde att de utgjorde en protein-protein-interaktionsdomän, kallad PDZ-ligand, som skulle kunna vara inblandad i detta. Mycket riktigt så visade det sig att hela effekten var beroende på en intakt receptorsvans där andra proteiner kan binda in och förmedla effekten. MAGUK-proteiner är proteiner som känner igen receptorer med PDZ-ligander och är kända för att vara inblandade i membranlokalisering och signalering. Därför testade vi en antikropp mot MAGUK-proteiner och glädjande nog hittade vi de i samma proteinkomplex som GPR30. MAGUK-proteiner i sin tur är kända för att associera med en mängd olika proteiner men bl.a. AKAP5 (A Kinase Anchoring Protein 5). Med hjälp av en antikropp mot AKAP5 så kunde vi slå fast att även AKAP5 befanns i samma komplex. AKAP5 är ett slags dockningsprotein och med det menar jag att en massa olika enzymer och effektormolekyler kan binda in till AKAP5. Exempelvis kinaser (som fosforylerar) och fosforylaser (som defosforylerar). cAMP- beroende proteinkinas A (PKA) är ett kinas som sitter ihop med AKAP5. Med hjälp av en liten peptid som stör PKA från att binda AKAP5 kunde jag reversera hämningen av cAMP även när GPR30 fanns närvarande. Mekanismen sattes i sten när vi ”knockade ner” AKAP5 ifrån celler som normalt uttrycker både AKAP5 och GPR30. Försvann AKAP5 så försvann också hämningen av cAMP. En ytterligare effekt vi såg var att förbehandling med PKA-AKAP-dissocierande peptid även gjorde att den spontana internaliseringen ökade. Sammanfattningsvis så bildar GPR30 alltså ett komplex med bl.a. MAGUK-proteiner och AKAP5 som förankrar receptorn i cellmembranet och samtidigt dämpar cAMP-signalering.

• author: Broselid, Stefan
• supervisor: Fredrik Leeb-Lundberg; Björn Olde
• opponent: Professor Milligan, Graeme, University of Glasgow
• organization: Drug Target Discovery (research group); BioCARE: Biomarkers in Cancer Medicine improving Health Care, Education and Innovation
• publishing date: 2014
• type: Thesis
• publication status: published
• subject: Pharmacology and Toxicology
• keywords: AKAP5, AKAP, MAGUK, cAMP signaling, constitutive signaling, signalosome, GPER, GPR30, GPCR, cytokeratin, RAMP3, apoptotic signaling, breast cancer, PDZ, PDZ-ligand
• in: Lund University Faculty of Medicine Doctoral Dissertation Series
• volume: 2015:2
• pages: 100 pages
• defense location: Segerfalksalen, Sölvegatan 17, BMC A12, Lund.
• defense date: 2015-01-09 13:00:00
• ISSN: 1652-8220
• ISBN: 978-91-7619-082-1
• language: English
• LU publication?: yes
• id: 0a9b8c66-6e66-4897-8682-1daef87b80f3 (old id 4858362)
• date added to LUP: 2016-04-01 14:51:43
• date last changed: 2023-04-18 20:05:38