Foodborne Virulence: Staphylococcus aureus Enterotoxins A and D

Abstract

The development of new, minimally processed food products

challenges traditional concepts of food safety. How pathogenic bacteria

behave in these new matrices is not known. To fill this knowledge gap

and enable the production of food that is safe for the consumer, more

information on virulence expression of pathogens in food matrices is

required.

In this thesis, the impact of environmental factors on foodborne

intoxication due to Staphylococcus aureus enterotoxin A (SEA) and D

(SED) expression and production is described. The study of

Campylobacter jejuni infection of the chicken GI tract was used to

compare the different mechanisms of virulence of the two foodborne

pathogens.

Studies on S. aureus demonstrated that under certain conditions,

e.g. low pH and lack of nutrients, the SEA production per cell was

increased. In the first part of these studies, when S. aureus was grown in

the presence of acetic acid, under controlled laboratory conditions; the

sea expression pattern was similar at all pH values studied, with the

expression peaking in the transition from exponential to stationary

growth phase, then falling in the stationary growth phase. The sea

expression was upregulated over a range of acetic acid concentrations,

and the increased expression could be linked to the activity of the seacarrying

prophage, showing that the prophage participated in the

regulation of virulence expression. A nucleotide sequence analysis of the

virulence region of six S. aureus strains carrying the sea gene showed

specific sea phage groups and two versions of the sea gene that may

explain the observed interstrain variance in SEA expression and

production levels.

S. aureus growth and SEA and SED expression and production were

then studied in vivo in four pork meat products. The intrinsic nature of

the meat products greatly affected the growth and expression patterns of

the organism. The number of S. aureus increased rapidly on the boiled

and smoked ham products. However, on the Serrano ham the number

of S. aureus cells did not increase until after seven days of incubation and

the microorganism did not survive on the salami investigated. In boiled

and smoked hams, active sea and sed expression was detected throughout

the one-week experiment, while the enterotoxin expression in pure

culture peaked after only a few hours of cultivation and then decreased

to low levels during the rest of the study. The SEA and SED levels on

boiled ham decreased unexpectedly after five days of incubation, maybe

due to extracellular proteolytic activity of S. aureus or lactic acid

bacteria.

Finally, the in vivo virulence of a pathogen causing foodborne

infection was studied by monitoring the dynamics of C. jejuni

colonization of the alimentary tract in chicken. Seven C. jejuni strains

simultaneously colonized two types of chicken, with different

gastrointestinal floras. The colonization patterns were the same in both

types of chicken, despite the different microbiota, showing that the

background flora had no major effect on the colonization order. Instead,

it was suggested that factors concerning the host, probably the host’s

immune response, affected the C. jejuni population during infection.

A greater understanding of how bacterial growth and virulence

expression are related and regulated by environmental factors and food

preservatives will provide safer food products and give rise to new

approaches to disease prevention and control in the future through the

improvement of quantitative risk assessments. The virulence of

foodborne pathogens can be an important complement to the viable

counts traditionally used in food safety assessments.

Abstract (Swedish)

Popular Abstract in Swedish

Uppskattningsvis 30 % av befolkningen i industrialiserade länder

drabbas varje år av förgiftningar och infektioner överförda via livsmedel

och frekvensen i utvecklingsländer tros vara högre. För att kunna

producera säker mat behövs mer kunskap om vilka egenskaper hos

livsmedelsburna patogener, dvs. sjukdomsframkallande mikroorganismer

som gör oss sjuka. Dessa egenskaper brukar med ett gemensamt namn

kallas för virulensfaktorer. Det är molekyler såsom gifter (toxiner) som

frisätts av mikroorganismer för att (i) möjliggöra infektion av värden, (ii)

undvika värdens immunförsvar och (iii) för att få näring.

I denna avhandling har virulens hos Staphylococcus aureus och

Campylobacter jejuni studerats, två av de vanligaste livsmedelspatogenerna.

Dessa två bakterier har olika mekanismer för att orsaka

sjukdom hos människa. S. aureus producerar gifter, enterotoxiner, som

ger de klassiska matförgiftningssymptomen kräkning, illamående,

magont och diarré. Medan bakterien är värmekänslig och avdödas vid

korrekt tillagning av maten, är enterotoxinerna extremt värmetåliga. Har

toxinerna väl bildats är det svårt att oskadliggöra dem. Det är därför

viktigt att förhindra att dessa gifter bildas i vår mat. Till skillnad från S.

aureus måste C. jejuni infektera vår tarm för att orsaka sjukdom. C.

jejuni finns naturligt i kycklingtarm utan att orsaka sjukdom hos

värddjuret. Kycklingköttet smittas av bakterien genom kontaminering

från tarmen under slakt. Tillagas köttet sedan inte ordentligt orsakas

magsjuka.

Genom att förstå vilka faktorer i S. aureus omgivning som påverkar

enterotoxiners uttryck (genexpression) och bildande (toxinproduktion)

kan man styra bakteriens virulens genom matproduktens sammansättning

och på så vis förbättra livsmedelssäkerheten. Traditionellt anses

mängden enterotoxiner som bildas vara kopplat till antalet S. aureus. Ju

fler bakterier som finns i maten, desto mer enterotoxiner bildas. Våra

resultat med enterotoxin A, det toxin som oftast är inblandat i

matförgiftning orsakat av stafylokocker, visar att så inte alltid är fallet.

Toxinmängden som bildades per bakteriecell ökade då bakterierna var

stressade vid t. ex. svält eller lågt pH. När vi studerade effekten av

ättiksyra, ett konserveringsmedel som sänker pH inuti bakterien, på

genexpressionen av S. aureus enterotoxin A såg vi att toxinproduktionen

såväl som frisättningen av det virus som bär på genen för enterotoxin A

faktiskt ökade vid vissa ättiksyrakoncentrationer. Virus som infekterar

bakterier kallas för bakteriofager. Dessa fagers genetiska material kan

fogas samman med bakteriens DNA inuti bakterie-cellen. Då detta sker

blir fagen passiv och kallas för en profag. Genen för enterotoxin A sitter

på just en sådan profag i S. aureus. Under vissa omständigheter aktiveras

fagen igen. Det är detta vi tror sker då S. aureus utsätts för svält eller lågt

pH. Då fagen aktiveras ökar expressionen av de gener, bl. a. genen för

enterotoxin A, som fagen bär på. Det innebär att försök att begränsa

tillväxten av S. aureus genom att förhindra tillgången på näring eller

genom att tillsätta konserveringsmedel istället kan leda till högre

enterotoxinmängder vilket ökar hälsoriskerna för konsumenten.

Huvudparten av den virulensforskning som görs idag sker i en

kontrollerad odlingsmiljö på laboratorier, på en bakteriekultur av bara

en typ av bakterie. Resultaten som fås reflekterar inte alltid situationen i

mat, som är en mer komplicerad miljö med flera typer av bakterier

närvarande samtidigt som interagerar med varandra. Då vi studerade

tillväxt av S. aureus vid rumstemperatur under en vecka i fyra olika

köttprodukter: kokt skinka, rökt skinka, lufttorkad Serranoskinka och

salami, såg vi att köttprodukternas olika egenskaper, såsom surhet,

närvaro av andra mikroorganismer och salthalt hade stor påverkan på S.

aureus tillväxt och enterotoxinproduktion. Medan bakterien snabbt

ökade i antal på kokt och rökt skinka, så sågs ingen ökning i S. aureusantal

på Serranoskinkan förrän efter sju dagar, och på salamin överlevde

bakterien inte. När vi jämförde genexpressionen av S. aureus enterotoxin

A och D i kokt och rökt skinka med genuttrycket i en bakteriekultur

sågs stora skillnader mellan de konstgjorda betingelserna och skinkorna.

I både kokt och rökt skinka såg vi aktiv genexpression av båda

enterotoxintyperna under hela det veckolånga experimentet, medan

enterotoxinerna endast uttrycktes i kultur under några få timmar under

experimentets första dag. Detta visar på vikten av att utföra

virulensstudier i miljöer så naturtrogna som möjligt, för att kunna

applicera resultaten på verkliga matprodukter.

Ett viktigt steg för att minska probelm med Campylobacter är att

bättre förstå hur spridningen kan minsaks till livsmedel genom att

förhindra bakteriens närvaro i kyckling. För att göra det behövs kunskap

om hur bakteriens infektion av kycklingtarm går till. Då kyckling

infekterades med flera C. jejuni-stammar samtidigt, såg vi att det var

faktorer hos kycklingvärden, antagligen kycklingens immunförsvar, som

låg bakom C. jejunis infektionsmönster. Denna upptäckt visar att det är

inte bara beror på mikroorganismen, utan även på värden, om och hur

en infektion sker.

Kunskapen som erhållits i denna avhandling kan användas för att

förbättra förvaring och konservering av matvaror. Den nya

informationen om virulens är betydelsefull för att förebygga

matförgiftning genom att utveckla kvantitativa riskbedömningar.

• author: Wallin, Nina
• supervisor: Peter Rådström
• opponent: Professor Jespersen, Lene, Faculty of Life Sciences, University of Copenhagen, Denmark
• organization: Applied Microbiology
• publishing date: 2010
• type: Thesis
• publication status: published
• subject: Industrial Biotechnology
• keywords: environmental factors, phage-encoded virulence, in vivo, enterotoxin D, enterotoxin A, gene expression, Staphylococcus aureus, virulence
• pages: 151 pages
• defense location: Lecture hall B, at the Center of Chemistry and Chemical Engineering, Getingevägen 60, Lund University Faculty of Engineering
• defense date: 2010-05-21 10:15:00
• ISBN: 978-91-7422-241-8
• language: English
• LU publication?: yes
• id: 481fe2dd-8158-48fd-bf97-b67f470e508e (old id 1591412)
• date added to LUP: 2016-04-04 10:53:21
• date last changed: 2018-11-21 21:01:22