Aggrecan fragments as biomarkers in osteoarthritis

Abstract

Background: In osteoarthritis (OA) the balance of cartilage matrix synthesis and degradation is disturbed, resulting in a gradual destruction of the articular cartilage. Matrix components released into body fluids by proteolytic cleavage can be used as biomarkers of ongoing processes. This thesis focuses on proteolytic degradation of the proteoglycan aggrecan with the overall aim to study the potential of aggrecan fragments as biomarkers in knee OA.



Methodology/Principal findings: Using neoepitope specific antibodies in Western blots, aggrecan fragments were identified in knee cartilage and synovial fluid (SF) pooled from individuals with a wide spectrum of disease. Aggrecanases were found to dominate aggrecan proteolysis in disease, although a contribution of matrix metalloprotease (MMP) activity was noted. Western blot quantification in individual samples showed that the proportion of aggrecan released into SF generated by aggrecanases varied in disease, and was higher in diagnostic groups associated with high disease activity. Quantification by ELISA of SF ARGS showed that SF ARGS better distinguished samples from patients with knee joint disease from samples obtained from knee healthy individuals than aggrecan measures not specific for this neoepitope. In patients meniscectomized 18 years earlier, SF ARGS levels were inversely associated with progression of radiographic OA.



Conclusions: Aggrecanase is the dominating protease in human knee OA and its activity toward the aggrecan interglobular domain (IGD) is elevated in disease. SF levels of aggrecan ARGS fragments generated by this IGD activity can be used as biomarkers and has diagnostic as well as prognostic capabilities.

Abstract (Swedish)

Popular Abstract in Swedish

Vid vår vanligaste ledsjukdom, artros, sker en progressiv förstöring av ledbrosk beroende på en störd balans mellan nedbrytning och nybildning av broskets extracellulära matrix. Ledbrosket utsätts för stort slitage och broskceller – kondrocyter – glest positionerade i vävnaden står för både nysyntes av broskmolekyler och för huvuddelen av nedbrytandet av slitna molekyler genom syntes av proteinklyvande enzymer – proteaser. Två familjer av proteaser har visat sig vara viktiga i omsättningen av ledbrosket: matrix metalloproteaser (MMP) och aggrekanaser. Dessa klyver framför allt kollagen II och aggrekan som, förutom vatten, är de två huvudbeståndsdelarna i ledbrosk. Kollagen II utgör ungefär 3/4 av vävnadens torrvikt, bildar ett fibrillerat nätverk som ger ledbrosket dess draghållfasthet, samt förankrar aggrekan och andra proteiner i vävnaden. Aggrekan utgör ungefär 1/5 av vävnadens torrvikt och är den molekyl i ledbrosket som ger det dess stötdämpande förmåga, detta genom sin stora negativa laddning vilken attraherar motjoner som i sin tur skapar det osmotiska tryck som håller vatten kvar i brosket.



Det övergripande syftet med denna avhandling var att utvärdera om klyvningsfragment av aggrekan utsläppta från brosket till den omgivande ledvätskan kan användas som indikatorer, eller biomarkörer, för artros. En biomarkör är en biologisk variabel som speglar en fysiologisk förändring till följd av t.ex. sjukdom. Biomarkörer kan användas vid diagnostisering, för att förutsäga vem som löper risk för att drabbas eller förvärras, eller för att följa om en behandling har effekt. De kan också användas för att studera bakomliggande biologiska mekanismer.



I första delarbetet gjordes en noggrann kartläggning av aggrekanfragment i brosk och ledvätska från ett stort antal patienter med varierande grad av artros eller knäskada. Antikroppar specifika för de nya aminosyresekvenser som blottläggs vid proteasklyvning, så kallade neoepitoper, användes i Western blot teknik. Denna teknik vidareutvecklades för att grovt kunna kvantifiera olika fragment. Kartläggningen i kombination med kvantifiering av några huvudfragment av aggrekanmolekylen visar att proteas i aggrekanasfamiljen ADAMTS spelar en huvudroll vid omsättningen av aggrekan i artros, även om aggrekanfragment kluvna av proteas ur familjen MMP också förekom.



Fördelen med kvantifieringsmetoden utvecklad i första delarbetet är att man, till skillnad från den vanligaste antikroppsbaserade kvantifieringsmetoden ELISA, kan särskilja och kvantifiera fragment av olika storlek samtidigt. Detta utnyttjades i andra delarbetet där ledvätskor från ett trettiotal patienter med olika ledsjukdomar jämfördes med knäfriska individers ledvätskor. Ledvätskenivåer av fragment kluvna av aggrekanas i två olika domäner av aggrekan jämfördes sinsemellan och med generellt aggrekaninnehåll. Resultaten identifierar fragment med den aggrekanasgenererade neoepitopen ARGS som en potentiell biomarkör och visar att andelen aggrekan med denna neoepitop varierar mellan olika ledsjukdomar och är större vid hög sjukdomsaktivitet.



Kvantifiering i Western blot kräver dock stora provmängder samt tidskrävande upparbetning och lämpar sig därför sämre för större provserier. I tredje delarbetet utökades antalet försökspersoner till 295 och ledvätskenivåer av ARGS-aggrekan mättes med en ELISA. Resultaten visar på mycket förhöjda ledvätskenivåer av ARGS-aggrekan vid ledsjukdom, i synnerhet vid inflammation och kort tid efter knäskada, men även vid knäartros. Lång tid efter knäskada var ARGS-nivåerna låga, men fortfarande förhöjda jämfört med nivåerna hos knäfriska och med mycket större spridning mellan olika individer. Jämfört med andra metoder som mäter generella nivåer av aggrekan, oavsett var fragmenten kluvits, är ledvätskenivån av ARGS avsevärt bättre på att särskilja prover från ledsjuka från de från knäfriska. Ledvätskenivåer av ARGS-aggrekan visades alltså vara en god biomarkör för ledsjukdom.



I fjärde delarbetet studerades ARGS-aggrekan i relation till sjukdomsprogress vid artros. I 141 patienter vilka opererats för meniskskada 18 år tidigare, mättes ledvätskekoncentrationen av ARGS-aggrekan och jämfördes med förändring av röntgenologiska kännetecken för artros 7,5 år senare. ARGS-nivåerna i ledvätska 18 år efter operation fanns vara samma som i kontrollindivider som inte opererats. Inom dessa till synes normala nivåer, visade sig risken för röntgenologisk sjukdomsprogress minska med ökande ledvätskenivåer av ARGS-aggrekan, vilket var förvånade då andra studier visat på förhöjda nivåer vid ledsjukdom. En trolig förklaring, som skulle innebära minskad risk för sjukdomsprogress med ökande ledvätskenivåer av ARGS inom det normala spannet, är en ökad nysyntes av aggrekan som till dels inkorporeras i vävnaden, men till dels klyvs av aggrekanas och sipprar ut i ledvätskan.



Sammanfattningsvis visar jag i denna avhandling att proteas tillhörande familjen aggrekanas är dominerande i artros och att aggrekanfragment med neoepitopen ARGS uppkommen genom aggrekanasklyvning är en biomarkör med diagnostisk så väl som prognostisk förmåga.

• author: Larsson, Staffan
• supervisor: Stefan Lohmander; André Struglics
• opponent: Professor Caterson, Bruce, Cardiff University, School of Biosciences, Cardiff, Wales, UK
• organization: Orthopaedics (Lund)
• publishing date: 2010
• type: Thesis
• publication status: published
• subject: Orthopedics
• keywords: protease, Aggrecan, osteoarthritis, proteoglycan, knee injury, biomarker, aggrecanase
• in: Lund University Faculty of Medicine Doctoral Dissertation Series
• volume: 2010:55
• pages: 130 pages
• defense location: Segerfalksalen, Wallenberg neurocenter, BMC, Sölvegatan 17, Lund
• defense date: 2010-05-14 09:00:00
• ISSN: 1652-8220
• ISBN: 978-91-86443-70-2
• language: English
• LU publication?: yes
• id: fdde2dda-2c46-463c-a0a4-bd075d50475c (old id 1593007)
• date added to LUP: 2016-04-01 13:05:19
• date last changed: 2023-04-18 20:44:38