Advanced

Nucleic Acids as Drugs and Drug Targets With Focus on Anticancer Active Platinum Complexes and Small Interfering RNAs

Hedman, Hanna LU (2011)
Abstract (Swedish)
Popular Abstract in Swedish

Titeln på den här avhandlingen är ”Nukleinsyror som läkemedel och mål för läkemedel, med fokus på anticanceraktiva platinaföreningar och små interferande RNA”. Nukleinsyror är mer kända som sina förkortningar DNA och RNA. Anticanceraktiva platinaföreningar är en typ av läkemedel mot cancer. Små interfererande RNA är en slags reglermekanism för hur mycket av ett visst protein som ska tillverkas i en cell. För att förklara hur detta hänger ihop krävs en förståelse för hur kroppens celler fungerar. Det här konceptet är så betydelsefullt att det brukar kallas ”Det centrala dogmat”. Namnet föreslogs av Francis Crick redan 1958 och det som slås fast i det centrala dogmat är hur genetisk information kan... (More)
Popular Abstract in Swedish

Titeln på den här avhandlingen är ”Nukleinsyror som läkemedel och mål för läkemedel, med fokus på anticanceraktiva platinaföreningar och små interferande RNA”. Nukleinsyror är mer kända som sina förkortningar DNA och RNA. Anticanceraktiva platinaföreningar är en typ av läkemedel mot cancer. Små interfererande RNA är en slags reglermekanism för hur mycket av ett visst protein som ska tillverkas i en cell. För att förklara hur detta hänger ihop krävs en förståelse för hur kroppens celler fungerar. Det här konceptet är så betydelsefullt att det brukar kallas ”Det centrala dogmat”. Namnet föreslogs av Francis Crick redan 1958 och det som slås fast i det centrala dogmat är hur genetisk information kan överföras och användas i cellen.

Idag vet vi att bilden är betydligt mer komplicerad, bl.a. genom att de olika stegen regleras på olika sätt, men i stort är det centrala dogmat fortfarande en bra förklaring av hur överföringen av genetisk information från DNA till proteiner går till.

Det här arbetet har fokuserat på RNA:s funktion, vilket därför kommer förklaras mer i detalj än DNA. RNA har många olika uppgifter i cellen och vanligtvis används prefix som syftar till den funktion ett specifikt RNA har. Exempel på detta är s.k. meddelande RNA (mRNA) d.v.s. de RNA-molekyler som fungerar som recept för ett visst protein. Ett annat exempel är små interfererande RNA (siRNA), de korta RNA molekylerna som kan reglera uttrycket av ett mRNA. Alla RNA

molekyler är uppbyggda av fyra olika byggstenar adenosine (A), cytosine (C), guanosine (G) och uracil (U). Dessa byggstenar parar ihop sig två och två, A binder till U och C till G. Detta gör att man kan få långa dubbelsträngade kedjor av RNA där den ena kedjan är en spegelbild av den andra. Detta innebär att en spegelbild av ett visst mRNA kan känna igen ett annat mRNA.

De korta siRNA-molekylerna som har undersökts i den här avhandlingen, är just sådana spegelbilder till ett specifikt mRNA. De är tillverkade som 21 byggstenar långa dubbelsträngade kedjor. Dessa kedjor kan dela på sig, och den ena kedjan kan binda till ett protein som fungerar som en sax. siRNA-molekylen letar upp det mRNA som är en spegelbild av siRNA:t, binder till det och proteinet klipper mRNA:t i två bitar. Eftersom varje protein har ett unikt recept (mRNA) går det att på syntetisk väg skapa ett siRNA som på ett specifikt sätt klipper sönder ett specifikt proteins mRNA.

Många sjukdomar beror på att ett protein finns i för stor mängd, eller att ett protein har tillverkats på fel sätt. Därför försöker forskare idag använda siRNA-molekyler som läkemedel för att återställa proteinbalansen i celler. Det är därför viktigt att veta hur dessa siRNA-moleyler påverkas av andra läkemedel vi använder idag. Hur påverkar platina-baserade läkemedel funktionen av siRNA?

Är en av frågeställningarna som diskuteras i denna avhandling.

Idag är tre platinaföreningar godkända att använda som läkemedel mot cancer i Sverige; cisplatin, oxaliplatin och carboplatin. De är alla tre läkemedelsmolekyler som har en kärna av en platinametalljon med olika grupper av atomer bundet till sig. Att platinaföreningar kan vara effektiva cellgifter upptäcktes på slutet av 1960-talet av Barnett Rosenberg och hans medarbetare. Platinaföreningarna binder till DNA, och det leder till att cellerna blir stressade och dör. DNA är inte den enda molekylen som platinaläkemedel kan binda till. RNA är kemiskt sett väldigt likt DNA, det är bara en extra syreatom som skiljer DNA och RNA åt. Denna extra syreatom ger dock RNA andra egenskaper än DNA, men molekyler som binder till DNA binder ofta enkelt även till RNA.

Arbetet som presenteras i den här avhandlingen handlar om vad som händer med siRNA-molekylers funktion i cellen när platinaföreningar är bundna till dem. För att ta reda på det har de två strängarna i siRNA-molekylen, modifierats var för sig med cisplatin eller oxaliplatin. När platinaföreningen är bunden till siRNA:t håller de två stängarna inte ihop lika bra. När det undersökts hur bra de platinamodiferade siRNA-molekylerna är på att nedreglera uttrycket av ett protein har det visat sig att det spelar roll vilken av de två strängarna som platinamolekylen sitter på. När spegelbilden till mRNA:t modifierats så är siRNA:t inte lika effektivt på att bryta ned mRNA:t. När den andra strängen modifieras, dvs. den delen av siRNA:t som inte används, så påverkar det däremot inte nedregleringsfunktionen hos siRNA:t.

En annan frågeställning som diskuteras i avhandlingen är:

Hur förändras egenskaperna hos platinaföreningar då platinatomens omgivning förändras?

I det här arbetet har nya platinaföreningar med en peptid bunden till sig undersökts.När dessa platina-peptid föreningar studerats kunde slutsatsen dras att typen av peptid styr effekten till stor del. Både positivt laddade peptider och oladdade peptider har undersökts. De oladdade petiderna hindrar platinamolekylen från att binda till DNA. Om en postivt laddad peptid används dras platinaföreningen till DNA som är negativt laddat och en ökad bindning till DNA observeras.

Arbetet som presenteras i denna avhandling beskriver hur platinabaserade cancerläkemedelpåverkar siRNA. Detta är av intresse dels för siRNA-molekyler som testas som potentiella läkemedel, och dessutom för att platinaläkemedel med största sannolikhet påverkar kroppens egna små interfererande RNA (miRNA). (Less)
Abstract
To ensure that patients receive a safe and effective treatment, it is important to understand how drugs interact with and affect molecules within a cell. Here, evaluation of platinum based drugs and their ability to interfere with nucleic acid functions is presented. The main focus of this thesis has been to evaluate whether siRNA efficiency can be modified by two clinically used anticancer active platinum complexes; cisplatin and oxaliplatin. To evaluate the potency of platinum based drugs with respect to direct modulation of protein synthesis, siRNA methodology and protein silencing capacity in a luciferse based system was used. In addition to cellular based assays, platinated nucleic acids were characterized by thermal meting studies,... (More)
To ensure that patients receive a safe and effective treatment, it is important to understand how drugs interact with and affect molecules within a cell. Here, evaluation of platinum based drugs and their ability to interfere with nucleic acid functions is presented. The main focus of this thesis has been to evaluate whether siRNA efficiency can be modified by two clinically used anticancer active platinum complexes; cisplatin and oxaliplatin. To evaluate the potency of platinum based drugs with respect to direct modulation of protein synthesis, siRNA methodology and protein silencing capacity in a luciferse based system was used. In addition to cellular based assays, platinated nucleic acids were characterized by thermal meting studies, HPLC, MALDI-MS, UPLC-ESI-MS and enzymatic and chemical probing resolved by PAGE.

siRNA guide and/or passenger strands were pre-platinated and gel-purified prior to experimental evaluation. Platination of the siRNA passenger strand was found not to perturb the protein down regulation significantly. Platination of the siRNA guide strand on the other hand was found to decreases the protein down regulation capacity up to seven fold, when the platinum modification was located in non-seed regions. The effect was more pronounced for oxaliplatin.

The thermal stability of RNA duplexes is reduced after platination. To evaluate if the observed platinum induced destabilization in the RNA environment was transferable to DNA, a thermal melting study was conducted. Analysis of the contributions from enthalpy and entropy to the free energy of duplex dissociation showed a larger variation in RNA.

A study was also conducted to evaluate the DNA binding properties of novel platinum complexes/peptide chimeras. The platinum complexes contained a nonapeptide with either basic (lysine) or aliphatic (glycine, alanine) amino acids. The bulky peptide retarded the platinum binding to DNA, an effect that was counteracted by the electrostatic attraction of the positively charged lysine residues.

Evaluation of the binding preference of cis-diamminedichloridoplatinum(II) (cisplatin) and dichloride [N,O-

(L)-ornitine]platinum(II) (O-platin) to rRNA was performed by incubation of rRNA with the two complexes followed by enzymatic degradation and evaluation by HPLC and mass spectrometry. A guanosine preference over adenosine was confirmed for cisplatin and the opposite binding preference was observed for O-platin.

We conclude that platinum drugs affect RNA function and can reduce siRNA efficiency. (Less)
Please use this url to cite or link to this publication:
author
supervisor
opponent
  • Professor Sigel, Roland K.O., University of Zürich, Switzerland
organization
publishing date
type
Thesis
publication status
published
subject
keywords
Anticancer drugs, platinum complexes, cisplatin, oxaliplatin, nucleic acid, RNA, DNA, siRNA, thermodynamic stability, mass spectrometry, MALDI-MS, chemical probing, luciferase assay
pages
192 pages
publisher
Department of Chemistry, Lund University
defense location
Kemicentrum, hörsal B
defense date
2011-09-24 10:15
ISBN
978-91-7422-277-7
language
English
LU publication?
yes
id
fe0b9d0d-e045-4b5b-acea-b2713554abfa (old id 2117466)
date added to LUP
2011-09-05 11:17:29
date last changed
2016-09-19 08:45:07
@phdthesis{fe0b9d0d-e045-4b5b-acea-b2713554abfa,
  abstract     = {To ensure that patients receive a safe and effective treatment, it is important to understand how drugs interact with and affect molecules within a cell. Here, evaluation of platinum based drugs and their ability to interfere with nucleic acid functions is presented. The main focus of this thesis has been to evaluate whether siRNA efficiency can be modified by two clinically used anticancer active platinum complexes; cisplatin and oxaliplatin. To evaluate the potency of platinum based drugs with respect to direct modulation of protein synthesis, siRNA methodology and protein silencing capacity in a luciferse based system was used. In addition to cellular based assays, platinated nucleic acids were characterized by thermal meting studies, HPLC, MALDI-MS, UPLC-ESI-MS and enzymatic and chemical probing resolved by PAGE. <br/><br>
 siRNA guide and/or passenger strands were pre-platinated and gel-purified prior to experimental evaluation. Platination of the siRNA passenger strand was found not to perturb the protein down regulation significantly. Platination of the siRNA guide strand on the other hand was found to decreases the protein down regulation capacity up to seven fold, when the platinum modification was located in non-seed regions. The effect was more pronounced for oxaliplatin. <br/><br>
 The thermal stability of RNA duplexes is reduced after platination. To evaluate if the observed platinum induced destabilization in the RNA environment was transferable to DNA, a thermal melting study was conducted. Analysis of the contributions from enthalpy and entropy to the free energy of duplex dissociation showed a larger variation in RNA.<br/><br>
 A study was also conducted to evaluate the DNA binding properties of novel platinum complexes/peptide chimeras. The platinum complexes contained a nonapeptide with either basic (lysine) or aliphatic (glycine, alanine) amino acids. The bulky peptide retarded the platinum binding to DNA, an effect that was counteracted by the electrostatic attraction of the positively charged lysine residues. <br/><br>
 Evaluation of the binding preference of cis-diamminedichloridoplatinum(II) (cisplatin) and dichloride [N,O-<br/><br>
(L)-ornitine]platinum(II) (O-platin) to rRNA was performed by incubation of rRNA with the two complexes followed by enzymatic degradation and evaluation by HPLC and mass spectrometry. A guanosine preference over adenosine was confirmed for cisplatin and the opposite binding preference was observed for O-platin. <br/><br>
 We conclude that platinum drugs affect RNA function and can reduce siRNA efficiency.},
  author       = {Hedman, Hanna},
  isbn         = {978-91-7422-277-7},
  keyword      = {Anticancer drugs,platinum complexes,cisplatin,oxaliplatin,nucleic acid,RNA,DNA,siRNA,thermodynamic stability,mass spectrometry,MALDI-MS,chemical probing,luciferase assay},
  language     = {eng},
  pages        = {192},
  publisher    = {Department of Chemistry, Lund University},
  school       = {Lund University},
  title        = {Nucleic Acids as Drugs and Drug Targets With Focus on Anticancer Active Platinum Complexes and Small Interfering RNAs},
  year         = {2011},
}