Molecular and microscopical analysis of pathogenic streptococci - studies on surface proteins interacting with human cells and extracellular matrix

Abstract

Association to specific host tissue structures allows pathogenic bacteria to establish an infection and facilitates the spread within its host. Interactions between bacterial surface structures and human proteins might determine the outcome of the infection. Streptococcus pyogenes (S. pyogenes), is a human pathogen mostly causing localized infections of the skin and respiratory tract, but it is also capable of causing severe invasive disease such as necrotizing fasciitis, sepsis and toxic shock. Until recently, S. pyogenes has been considered as a strictly extracellular pathogen, but several studies has shown that it is capable of invading and surviving intracellularly in several human cell types. In this thesis I have investigated the interaction of S. pyogenes and Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae) with collagen type VI, the binding of S. pyogenes M1 protein and leucine rich (Slr) protein to collagen type I, and Slr’s interaction with human keratinocytes. The adherence of S. pyogenes and S. pneumoniae to collagen type VI in murine upper and lower airways was restricted to the proximity of the NH2 - and COOH-terminal globular domains of collagen type VI, and for S. pyogenes this interaction was mediated by the M1 protein. The M1 protein and Slr are co-expressed on the bacterial surface and both bind to collagen type I with high affinity. Slr exhibited multiple binding sites to collagen I, both to the monomeric and the fibrillar structure, with the most binding concentrated to the overlap region of the collagen I fibril. Slr is able to adhere to and internalize into human keratinocytes (HaCaT) cells in a time dependent manner and we were able to identify non-muscle myosin IIA as a potential cellular ligand for Slr. We could further confirm the presence of non-muscle myosin IIA in HaCat cell lysate and that Slr binds to non-muscle myosin IIA. In summary, we have characterized a novel adhesin of S. pyogenes, Slr, as a LRR containing lipoprotein that, in concert with the M1 protein, might utilize collagens as adhesive targets during the infection process. Slr and M1 bind to collagen type I, and M1 also binds to collagen type VI, a process that might play a role in the primary step of infection in the skin and respiratory tract. Furthermore, Slr binds to non-muscle myosin IIA possibly resulting in the bacterial adherence to and internalization into human keratinocytes. This could contribute to S. pyogenes avoidance of the immune system and/or bacterial dissemination into deeper tissues.

Abstract (Swedish)

Popular Abstract in Swedish

Vi är omringade av olika mikrorganismer såsom bakterier och svampar. Bakterier kan leva från de mest ogästvänliga miljöer som arktisk is och varma källor på havsbotten till varje människas hud och mag- tarmkanal. Bakterier som bor på och inuti oss spelar en stor roll i vårt välbefinnande. De hjälper oss att smälta maten och hindrar andra mer farliga bakterier från att bosätta sig på vår hud. Vi använder oss av olika bakterier för att tillverka vacciner som skyddar oss från sjukdom och de används i tillverkning av diverse matprodukter såsom ostar och öl. En av skyddsmekanismerna mot bakterier är de fysiska barriärena såsom hud och slemhinnor. En del av bakterierna kan under vissa omständigheter orsaka lokal skada på hud och slemhinnor, men kan även ibland sprida sig djupare in i vävnaden eller ta sig till blodbanan. För att kunna ta sig in och kolonisera sin värd måste bakterierna kunna binda till ytstrukturer på celler eller till proteiner som finns i det extracellulära matrixet (ECM, som är ett lager av olika proteiner som finns under celler och som bland annat ger stadga till cellerna) som finns under cellerna. Detta gör bakterierna med hjälp av proteiner som finns på deras cellyta. Det extracellulära matrixet finns i alla typer av vävnader i kroppen, men speciellt mycket i bindväv och brosk. I ECM finns det olika proteiner, ett av dessa är kollagen som bildar fiberstrukturer. Dessa fiberstrukturer ger stadga och är mycket motståndskraftiga mot slitande krafter. Kollagen står för ca 25 % av det totala mängden protein i våra kroppar. Kollagen består av tre peptidkedjor (korta proteiner) snurrade runt om varandra och bildar en trippelhelixform. Trippelhelixen bildas inne i cellen och kallas då prokollagen. Prokollagen molekylerna utsöndras av cellerna och går ihop för att bilda tjockare kollagenfiber. Det finns olika grupper av kollagener beroende på uppbyggnad, funktion och var i kroppen de finns. Bakterier har ett flertal olika proteiner som kan binda till kollagen. Streptococcus pyogenes (S.pyogenes) som mitt avhandlingsarbete har handlat om har ett ytprotein Cpa som kan binda till kollagen typ I som är väldigt vanlig i hud. S.pyogenes är en gram-positiv bakterie som oftast växer i par eller kedjor. Den kan orsaka relativt ofarliga infektioner såsom halsfluss och hudinfektioner (sk. impetigo som förekommer oftast hos barn), men kan även orsaka livshotande tillstånd som blodförgiftning och nekrotiserande fasciit (tillstånd där bakterien angriper djupare vävnad, muskler och fett). Jag har undersökt om streptokocker kan binda till olika kollagener, som i sin tur kan underlätta för bakterien att hålla sig kvar i det infekterade området eller möjliggöra bakteriens spridning i kroppen.



I delarbete I har vi undersökt om Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae) och S. pyogenes kan binda till kollagen typ IV. Detta kollagen finns i övre och nedre luftvägarna och kan vid mekanisk skada eller som föjld av en virusinfektion bli blottat och då tillgängligt för bakterier. Vi kunde visa att kollagen typ VI hos möss finns i luftstrupen och bronkerna (som är förgreningar från luftstrupen) genom att använda oss av antikroppar som är riktade mot kollagen typ VI. Vi kunde visa att hela S. pneumoniae och S. pyogenes bakterier och proteiner som klipptes från bakteriens yta kunde binda till kollagen typ VI. Med hjälp av elektronmikroskopi (en metod där man använder sig av elektroner istället för ljus för att erhålla en bild) kunde vi visa att kollagen typ VI kan binda till bakteriens yta, att de klippta proteinerna från bakterierna binder till en specifik del på kollagen typ VI fibern (den globulära domänen) och att det för S. pyogenes är M1-proteinet som står för bindningen till kollagenet.



I delarbete II undersökte vi om M1-proteinet och Slr proteinet från S. pyogenes kan binda till kollagen typ I (som är väldigt vanligt i hud) och kan använda det som hjälp att bibehålla sitt fäste vid infektion. Vi producerade Slr proteinet i E. coli (som är en lätt manipulerad bakterie som ofta används för att producera proteiner) och kunde visa att det är ett lipoprotein som innehåller leucinrika (LRR) områden med likhet till InlA som är ett protein hos Listeria monocytogenes (en annan typ av bakterie som kan orsaka sjukdom hos människan). Vi kunde visa att både Slr och M1-proteinet kan binda till kollagen typ I och att dessa proteiner under en period finns samtidigt på bakteriens yta. Vi gick sedan vidare med att genetiskt manipulera S. pyogenes så att den inte kan uttrycka hela Slr proteinet på sin yta. Därefter jämförde vi ursprungsstammen (AP1, som har både M1-proteinet och Slr på sin yta) och två mutanters (MB1 som saknar Slr och MC25 som saknar M1-proteinet) kapacitet att binda till kollagen typ I. Vi kunde, med olika metoder, visa att AP1 band starkast medan MB1 och MC25 hade minskad bindningsförmåga.



I delarbete III har vi undersökt om Slr kan binda till och ta sig in i mänskliga hudceller. Förmågan att ta sig in i mänskliga celler kan hjälpa bakterien att sprida sig i kroppen samt att kunna undkomma vårt immunförsvar som ska döda bakterierna vid en infektion. Vi fann att Slr kan binda till hudceller samt kan ta sig in i cellerna. Vi identifierade myosin 9 som det protein i hudcellerna som Slr kan använda sig av för att binda till och ta sig in i hudcellerna. Myosiner är en familj av proteiner som är involverade i celltillväxt och rörlighet, men studier har visat att de kan vara inblandade i bakteriers inträde i mänskliga celler.



Sammanfattningsvis så har jag i mitt avhandlingsarbete karaktäriserat ett nytt protein hos S. pyogenes, Slr, ett lipoprotein med LRR-segment som tillsammans med M1- proteinet kan binda till kollagener i början av en infektion. Slr och M1 binder till kollagen typ I, och M1 binder även till kollagen typ VI, en mekanism som kan vara viktig för att orsaka infektion i hud och andningsorgan. Slr kan även binda till myosin 9 och på detta sätt binda till och ta sig in i mänskliga hudceller. Denna mekanism kan resultera i att bakterien möjligtvis kan komma undan immunsystemet och/eller sprida sig till djupare vävnad. Dessa arbeten ger oss en större förståelse för hur infektionsprocessen går till.

• author: Bober, Marta
• supervisor: Mattias Collin; Matthias Mörgelin; Maria Allhorn
• opponent: Associate professor Neely, Melody, Department of Immunology and Microbiology, Wayne State University, Detroit, Michigan, USA
• organization: Infection Medicine (BMC)
• publishing date: 2011
• type: Thesis
• publication status: published
• subject: Infectious Medicine
• keywords: Streptococcus pyogenes, streptococcal leucine rich repeat protein, M protein, collagen, keratinocytes
• in: Lund University Faculty of Medicine Doctoral Dissertation Series
• volume: 2011:90
• pages: 122 pages
• defense location: Belfragesalen, BMC, D15
• defense date: 2011-11-04 09:00:00
• ISSN: 1652-8220
• ISBN: 978-91-86871-39-0
• language: English
• LU publication?: yes
• id: 9fcb90be-e0a5-4a54-b44a-b29115cf63bc (old id 2164587)
• date added to LUP: 2016-04-01 15:07:15
• date last changed: 2023-04-18 20:00:15