Exocytosis in Type 2 Diabetes- Functional and genetic studies of hormone secretion

Abstract

Type 2 Diabetes (T2D) is characterized by dysregulated beta-and alpha-cell hormone secretion leading to elevated blood glucose levels. Several proteins are crucial in maintaining exocytosis of the hormone-containing granules such as Syntaxin1A (Stx1A), SNAP25, Munc-18 (Stxbp1) and the family of Synaptotagmins (Syts). The aim of this thesis has been to investigate functional and genetic events that participate in the exocytotic process.



First we show that SNAP25 is essential for cAMP-dependent rapid exocytosis in insulin-secreting cells, and that the effect may be mediated by binding to cAMP-GEFII (paper I). In mouse alpha-cells, SNAP25 and Stx1A display a glucose-dependent localization where immunoneutralization of SNAP25 and Stx1A strongly reduce the exocytotic response (paper II). In paper III, the mRNA expression levels of 23 genes with known function in exocytosis was compared in human beta-cells from non-diabetic (ND) and T2D donors which revealed that STX1A, SYT4, SYT7, SYT11 and SYT13 is nominally down-regulated in T2D beta-cells and concomitantly correlate positively with glucose stimulated insulin secretion (GSIS) and negatively with HbA1c levels. Furthermore, silencing of Syt4, Syt7 and Syt13 in INS1-832/13 cells correlate with reduced levels of GSIS. In paper IV exocytosis in human beta-cells was studied to generate a risk score consisting of 4 SNPs in or near TCF7L2, KCNJ11, ADRA2A and KCNQ1 that successfully predict reduced exocytosis, calcium-sensitivity, granular docking and GSIS. Finally, in paper V, knock-down of rno-microRNA-335 in insulin-secreting cells was found to increase Stxbp1 expression which correlates with increased exocytosis.



Within the scope of this thesis we establish that exocytosis is an important part of glucose homeostasis and that a broad range of factors can influence the exocytotic outcome. In this context, regulation of exocytosis span from the transcription of DNA, translation, transport and function of exocytotic proteins as well as their intricate interactions with one another. All while maintaining the correct cues in response to increased levels of intracellular calcium either amplified by second messengers or triggered by glucose-stimulated coupling. Taken together, extensive research on the molecular mechanisms participating in hormone exocytosis may well contribute to future treatment of the reduced insulin secretion apparent in T2D.

Abstract (Swedish)

Popular Abstract in Swedish

Typ 2 Diabetes (T2D) räknas som en folksjukdom i Sverige vilket innebär att den är så vanlig att

minst 4 % av befolkningen är drabbad. Förekomsten av diabetes ökar lavinartat över hela världen

och man beräknar att så många som 300 miljoner människor har diabetes idag.



Socker är en livsviktig energikälla, men lagom är bäst

Socker i mat förs ut till blodet och används som energi i kroppen. För mycket socker skadar

blodkärlen så att risken för hjärtinfarkt ökar, medan för låga nivåer leder till akut energibrist framförallt i hjärnan vilket kan resultera i koma. Bukspottskörteln har sensorer som känner av sockernivån i blodet och motverkar för högt eller för lågt socker genom hormonfrisättning. Vid höga sockernivåer frisätts hormonet insulin vilket signalerar att fettet, musklerna, levern och hjärnan skall samla upp socker från blodet så att mängden ”fritt” socker minskar. Ifall sockernivån sjunker till för låga nivåer upphör bukspottskörteln att frisätta insulin och börjar istället leverera ett annat hormon, glukagon, som signalerar till levern att den skall frisätta socker till blodet. På så sätt balanserar bukspottskörteln, via insulin och glukagon, hela tiden blodets sockernivå.



Tre källor till skadligt höga sockernivåer hos individer med T2D

Vid T2D är tre skeden framträdande, antingen var för sig eller i kombination:

1) Frisättning av glukagon trots normala eller förhöjda blodsockernivåer leder till att höja

sockerhalten ännu mer

2) Högt sockerintag leder till ökad frisättning av insulin vilket kan leda till en slags

utbrändhet i fettet och musklerna som ständigt stimuleras och dessa blir tillslut resistenta

mot insulin

3) Frisättningen av insulin från bukspottskörteln försämras vilket leder till att inte

tillräckligt med insulin finns i omlopp för att sänka blodsockret.



I denna avhandling har jag främst undersökt det tredje skedet; Olika faktorer som kan leda till att frisättningen av insulin försämras.



Hur insulin hamnar i blodet - Exocytos

Inuti bukspottskörtelns celler ligger insulinet förpackat i kapslar. Vid höga sockernivåer smälter kapslarna samman med cellens skal så att insulinet hamnar i blodet. Denna sammansmältning kallas i vetenskapliga termer för exocytos. Exocytosen sker med hjälp av snaror på kapslarna som binder in till två kompletterande snaror (Syntaxin1A och SNAP25) i cellens skal. Vidare finns det strukturer (t.ex. Synaptotagminer) som agerar ”klister” och förbättrar snarornas inknytning. Vår hypotes är att olika delar av exocytosen är försämrad vid T2D.



T2D i vårt DNA?

Stx1A, SNAP25 och Synaptotagminer är alla proteiner. Information som behövs för att kunna bilda

proteiner finns lagrat i våra gener i spiraler av DNA-strängar inuti varje cell. Varje individs DNA genomgår spontana förändringar (mutationer). I de flesta fall gör dessa mutationer inte någon skillnad, men ibland förbättras eller försämras funktionen hos de proteiner som bildas från en muterad gen. Risken att utveckla T2D är delvis ärftlig. Därför försöker man undersöka gener för att se om det finns mutationer som är extra vanliga hos människor med diabetes, och i så fall, om mutationerna gör att motsvarande protein förändras. DNA-strängarna består inte enbart av proteinbildande gener, det finns också delar av DNA som bildar ytterst små partiklar som inte är protein. Dessa kallas för microRNA och justerar faktiskt hur mycket protein som bildas från generna och leder oftast till att mindre protein bildas.



Fem studier av Exocytos

I denna avhandling har jag i fem delar studerat olika aspekter av den exocytotiska processen:

1) Vi har studerat strukturen och funktionen av proteinet SNAP25 och kommit fram till att skilda delar av SNAP25 bidrar till olika steg under exocytosen av insulin.

2) Vi har också undersökt celler som innehåller glukagon och studerat om det finns mindre SNAP25 och Syntaxin1A i cellens skal vid förhöjda sockernivåer. Vi kom fram till att deras

placering i cellen är sockerberoende och att de är nödvändiga för att exocytosen av

glukagon skall fungera normalt.

3) Vidare har jag undersökt proteinmängder hos personer med T2D. Vi fann att individer med T2D generellt har mindre Syntaxin 1A och Synaptotagmin och att människor som har färre av dessa proteiner tenderar att ha högre blodsockernivåer, vilket vi tolkar som att de har en försämrad exocytos som bidrar till att de har mindre insulin i blodet.

4) Flera forskare har visat att fyra gener ofta är muterade hos människor med T2D. Vi undersökte om dessa gener parallellt ger en större effekt än om man har varje muterad gen för sig. Vi kom fram till att ju fler av dessa muterade gener en individ har, desto sämre fungerar insulinfrisättningen.

5) En tidigare studie har visat att råttor med diabetes har högre halter av ett specifikt

microRNA som minskar mängden av ett protein som ingår i exocytosen. När vi förhindrade funktionen av detta microRNA bildades mer av proteinet och exocytosen förbättrades i insulin-innehållande celler.



Sammanfattning

Sammantaget visar våra studier att flera faktorer kan leda till en förändrad exocytos, från

mutationer i gener till funktionen av proteiner, och att försämrad exocytos direkt korrelerar till försämrad insulinfrisättning. Sålunda torde dessa omständigheter bidra till förhöjda sockernivåer i T2D. Genom att noggrant utreda de exakta mekanismerna som styr den försämrade exocytosen hoppas vi att framtidens medicinering kan bli mer individualiserad och bättre riktad mot specifika proteiner eller processer för att förebygga, eller underlätta behandlingen av, skadligt förhöjda blodsockernivåer i T2D.

• author: Andersson, Sofia A
• supervisor: Lena Eliasson; Erik Renström; Dina Speidel; Jonathan Esguerra
• opponent: Professor Ullrich, Susanne, Department of Internal Medicine, University of Tübingen, Germany
• organization: Diabetes - Islet Cell Exocytosis (research group); EXODIAB: Excellence of Diabetes Research in Sweden
• publishing date: 2012
• type: Thesis
• publication status: published
• subject: Endocrinology and Diabetes
• keywords: Type 2 Diabetes, Insulin, Glucagon, Alpha-cells, Beta-cells, Exocytosis, Capacitance, SNARE, SNAP25, Syntaxin1A, Synaptotagmin, Munc-18 (Stxbp1), SNP, Expression, miRNA
• in: Lund University Faculty of Medicine Doctoral Dissertation Series
• volume: 2012:35
• pages: 155 pages
• defense location: CRC Auditorium, Entrance 72, Skåne University Hospital, Malmö
• defense date: 2012-05-11 13:15:00
• ISSN: 1652-8220
• ISBN: 978-91-86871-97-0
• language: English
• LU publication?: yes
• id: 19d86440-53da-4e4e-b07e-07fdad8415ab (old id 2440033)
• date added to LUP: 2016-04-01 14:30:48
• date last changed: 2019-05-22 06:19:19