Advanced

Unravelling protein stability and aggregation

Weiffert, Tanja LU (2018)
Abstract (Swedish)
Proteiner är fascinerande makromolekyler som är fundamentala för alla levande
organismer. De utgör byggstenar i våra celler, ansvarar för transport och signalering både inom och mellan våra celler, utgör en del av vårt immunförsvar och katalyserar bildningen av andra molekyler. Proteiner består av flexibla kedjor uppbyggda av olika aminosyror. Varje aminosyra har olika egenskaper och den specifika ordningen av aminosyror bestämmer såväl den tredimensionella strukturen som funktionen av proteinet. För att förstå hur proteiner i kroppen fungerar och hur de är kopplade till olika sjukdomar behöver vi förstå deras grundläggande egenskaper såsom stabilitet, vad som styr veckningen av aminosyrorna till en tredimensionell struktur samt hur de... (More)
Proteiner är fascinerande makromolekyler som är fundamentala för alla levande
organismer. De utgör byggstenar i våra celler, ansvarar för transport och signalering både inom och mellan våra celler, utgör en del av vårt immunförsvar och katalyserar bildningen av andra molekyler. Proteiner består av flexibla kedjor uppbyggda av olika aminosyror. Varje aminosyra har olika egenskaper och den specifika ordningen av aminosyror bestämmer såväl den tredimensionella strukturen som funktionen av proteinet. För att förstå hur proteiner i kroppen fungerar och hur de är kopplade till olika sjukdomar behöver vi förstå deras grundläggande egenskaper såsom stabilitet, vad som styr veckningen av aminosyrorna till en tredimensionell struktur samt hur de interagerar med sig själv och andra proteiner eller makromolekyler. I denna avhandling undersöker jag främst proteiners stabilitet och hur de associerar med kopior av sig själva
för att bilda aggregat. Än idag hittar forskare nya proteiner med nya egenskaper och mycket forskning krävs för att vi verkligen ska förstå varje proteins egenskaper. I artikel I har vi undersökt stabiliteten av ett protein – secretagogin – som först upptäcktes år 2000 och som troligtvis har en roll i transporten av ämnen mellan celler. Secretagogin visade sig gärna para ihop sig två och två, dvs forma dimerer, och i vilken mån dimerer bildas beror på miljön som proteinet befinner sig i. Det är välkänt att människor behöver äta proteiner för att få i sig alla essentiella aminosyror som vår kropp behöver för att kunna tillverka våra egna proteiner. Något som är mindre välkänt är att det finns proteiner med söt smak. Idag går det tyvärr inte att köpa söta proteiner i din livsmedelsbutik för att ersätta sockret när du lagar mat. En av anledningarna är att de söta proteinerna inte är stabila nog att kokas. I artikel II har vi vidareutvecklat en metod som vi använder för att hitta stabilare varianter av proteiner. Med hjälp av denna metod undersökte vi om vi kunde hitta stabilare mutanter av ett sötsmakande protein – monellin. Vi fann en monellinmutant, där en aminosyra hade ersatts av en annan, som är stabilare än den naturligt förekommande varianten, med bibehållen söt smak. Denna variant av monellin kan värmas till högre temperaturer utan att dess tredimensionella struktur påverkas nämnvärt och kan potentiellt användas i matlagning. Flera av våra vanligaste sjukdomar beror på att proteinerna i vår kropp inte uppfyller sin funktion. Sjukdomarna kan t.ex. bero att mutationer i vårt DNA ger upphov till proteinvarianter med förändrade egenskaper eller att de system som reglerar mängden av olika protein i vår kropp har mist sin funktion. Många sjukdomar, såsom diabetes typ 2, Alzheimers sjukdom och Parkinsons sjukdom, orsakas av att proteiner associerar med sig själva (aggregerar) och bildar fibriller. För att kunna hitta effektiva behandlingsmetoder behöver vi, bland annat, förstå de grundläggande mekanismer som orsakar sjukdomstillståndet och hur sjukdomen sprids mellan celler. I denna avhandling undersöker vi ett kort protein (en så kallad peptid), amyloid beta (Abeta), som troligtvis orsakar Alzheimers sjukdom. Abeta peptider aggregerar och bildar fibriller som
slutligen formar plack i hjärnan. Det finns många olika Abeta peptider av varierande längd samt ett flertal mutanter. I artikel III har vi studerat aggregeringsprocessen för en kort Abeta peptid, Ab5-42, och hur denna peptid påverkar aggregeringsprocessen för en längre variant, Ab42. Vi visar att den korta Abeta peptiden formar fibriller ännu snabbare än den långa varianten. Den ökade aggregeringshastigheten för Ab5-42 beror främst på att peptiderna snabbare associerar med varandra och med de existerande fibrillerna. I artikel IV undersöker vi hur yttre faktorer i Abeta peptidernas omgivning inverkar på
aggregeringsprocessen. Genom att tillsätta två sorters molekyler, som man vanligtvis använder inom proteinforskning för att destabilisera proteiner, påverkar vi aggregeringshastigheten. En av de tillsatta molekylerna är ett salt, som består av en positiv och en negativt laddad jon, och den andra molekylen är oladdad. Den destabiliserande effekten av de tillsatta oladdade molekylerna leder till långsammare aggregering. De laddade molekylerna påverkar aggregeringen på två sätt: den destabiliserande effekten saktar ner aggregeringen och salteffekten accelererar aggregeringen. Vilken effekt som dominerar beror på hur mycket av de laddade molekylerna som har tillsatts till Abeta peptiderna - vid låga koncentrationer ökar aggregeringshastigheten och vid höga koncentrationer sänks aggregeringshastigheten. Slutligen, i artikel V, använder vi vår kunskap om aggregeringsprocessen för att visa hur man kan ta fram korta versioner av antikroppar, som hindrar det steg i processen som ger upphov till majoriteten av de toxiska aggregat som orsakar nervskador i Alzheimers sjukdom.
I längden hoppas jag att studierna av proteiners grundläggande egenskaper som utgör denna avhandling, kan bidra till bättre förståelse för hur proteiner fungerar, hur vi kan använda dem och hur vi bäst kan behandla sjukdomar såsom Alzheimers sjukdom. (Less)
Abstract
Proteins are complex macromolecules that are fundamental to all living species. The stability of proteins are governed by non-covalent forces within the protein and between the protein and its surrounding environment. At high concentrations proteins are susceptible to self-association, which may lead to amyloid fibril formation – a process linked to many diseases, such as Alzheimer’s disease, Parkinson’s disease and type II diabetes. Fibril formation is believed to be a generic property of proteins and the formation of amyloid fibrils occur at protein concentrations exceeding the critical aggregation concentration.
The objective of this thesis was to study protein stability and aggregation and the noncovalent forces governing these... (More)
Proteins are complex macromolecules that are fundamental to all living species. The stability of proteins are governed by non-covalent forces within the protein and between the protein and its surrounding environment. At high concentrations proteins are susceptible to self-association, which may lead to amyloid fibril formation – a process linked to many diseases, such as Alzheimer’s disease, Parkinson’s disease and type II diabetes. Fibril formation is believed to be a generic property of proteins and the formation of amyloid fibrils occur at protein concentrations exceeding the critical aggregation concentration.
The objective of this thesis was to study protein stability and aggregation and the noncovalent forces governing these processes. We showed that the EF-hand protein secretagogin is highly stable at physiological conditions, and that the protein structure is further stabilized by Ca2+ binding. Secretagogin contains intra- and intermolecular disulfide bonds and the protein forms dimers and oligomers in a redox-dependent manner. Interestingly, the disulfide bond does not contribute to the stability implying that the disulfide bond is not well accommodated in the most stable structure of the protein. In order to derive stabilized protein variants we applied an in vivo screening method based on the thermodynamic linkage between fragment complementation and protein stability. This method relies on the split GFP system and the thermodynamic linkage between protein fragment reconstitution and the stability of the intact protein. Using this method we derived a stabilized variant of the sweet tasting protein monellin, with retained sweetness, from a random library. Furthermore, we investigated the influence of sequence and solution conditions on the aggregation behaviour of the amyloid β42 peptide (Aβ42), involved in Alzheimer’s disease. In vivo, Aβ peptides of many different lengths are found and we showed that the aggregation is accelerated for an N-terminally truncated peptide, Aβ5-42, compared to the full length Aβ42 peptide. While the elongation rate is very similar between the two species the nucleation steps are significantly accelerated for the truncated peptide, which is due to the lower net charge and the shorter length of the nonamyloidogenic part of the truncated peptide. Thus, we can establish that the N-terminus of the Aβ42 peptide is important in governing primarily the secondary nucleation rate, even though the N-terminus is not part of the fibril forming core. We addressed the influence of the solution conditions on the aggregation mechanism of Aβ42 by adding denaturants to the aggregation process. Addition of non-ionic urea decrease the aggregation rate of Aβ42, while addition of ionic GuHCl accelerates the aggregation at low concentrations and decreases the rate at high concentrations. Finally, we applied our knowledge of the aggregation mechanism of Aβ42 to derive single chain antibody fragments that specifically inhibit the surface catalyzed nucleation step, with the aim to reduce the amount of toxic oligomeric species.
(Less)
Please use this url to cite or link to this publication:
author
supervisor
opponent
  • Professor Hammarström, Per, Linköping University, Sweden
organization
publishing date
type
Thesis
publication status
published
subject
keywords
protein stability, protein aggregation, amyloid beta peptide, protein stabilization, split GFP, monellin, secretagogin,, aggregation kinetics, toxicity, aggregation mechanism, coaggregation
pages
244 pages
publisher
Media-Tryck, Lund University, Sweden
defense location
Lecture Hall C, Kemicentrum, Naturvetarvägen 14, Lund
defense date
2018-11-23 09:00
ISBN
978-91-7422-603-4
978-91-7422-602-7
language
English
LU publication?
yes
id
24a92e49-4613-4fc4-bcd6-e9feccd1ef75
date added to LUP
2018-10-29 13:57:03
date last changed
2019-02-26 13:04:17
@phdthesis{24a92e49-4613-4fc4-bcd6-e9feccd1ef75,
  abstract     = {Proteins are complex macromolecules that are fundamental to all living species. The stability of proteins are governed by non-covalent forces within the protein and between the protein and its surrounding environment. At high concentrations proteins are susceptible to self-association, which may lead to amyloid fibril formation – a process linked to many diseases, such as Alzheimer’s disease, Parkinson’s disease and type II diabetes. Fibril formation is believed to be a generic property of proteins and the formation of amyloid fibrils occur at protein concentrations exceeding the critical aggregation concentration.<br/>The objective of this thesis was to study protein stability and aggregation and the noncovalent forces governing these processes. We showed that the EF-hand protein secretagogin is highly stable at physiological conditions, and that the protein structure is further stabilized by Ca2+ binding. Secretagogin contains intra- and intermolecular disulfide bonds and the protein forms dimers and oligomers in a redox-dependent manner. Interestingly, the disulfide bond does not contribute to the stability implying that the disulfide bond is not well accommodated in the most stable structure of the protein. In order to derive stabilized protein variants we applied an in vivo screening method based on the thermodynamic linkage between fragment complementation and protein stability. This method relies on the split GFP system and the thermodynamic linkage between protein fragment reconstitution and the stability of the intact protein. Using this method we derived a stabilized variant of the sweet tasting protein monellin, with retained sweetness, from a random library. Furthermore, we investigated the influence of sequence and solution conditions on the aggregation behaviour of the amyloid β42 peptide (Aβ42), involved in Alzheimer’s disease. In vivo, Aβ peptides of many different lengths are found and we showed that the aggregation is accelerated for an N-terminally truncated peptide, Aβ5-42, compared to the full length Aβ42 peptide. While the elongation rate is very similar between the two species the nucleation steps are significantly accelerated for the truncated peptide, which is due to the lower net charge and the shorter length of the nonamyloidogenic part of the truncated peptide. Thus, we can establish that the N-terminus of the Aβ42 peptide is important in governing primarily the secondary nucleation rate, even though the N-terminus is not part of the fibril forming core. We addressed the influence of the solution conditions on the aggregation mechanism of Aβ42 by adding denaturants to the aggregation process. Addition of non-ionic urea decrease the aggregation rate of Aβ42, while addition of ionic GuHCl accelerates the aggregation at low concentrations and decreases the rate at high concentrations. Finally, we applied our knowledge of the aggregation mechanism of Aβ42 to derive single chain antibody fragments that specifically inhibit the surface catalyzed nucleation step, with the aim to reduce the amount of toxic oligomeric species.<br/>},
  author       = {Weiffert, Tanja},
  isbn         = {978-91-7422-603-4},
  keyword      = {protein stability,protein aggregation,amyloid beta peptide,protein stabilization,split GFP,monellin,secretagogin,,aggregation kinetics,toxicity,aggregation mechanism,coaggregation},
  language     = {eng},
  pages        = {244},
  publisher    = {Media-Tryck, Lund University, Sweden},
  school       = {Lund University},
  title        = {Unravelling protein stability and aggregation},
  year         = {2018},
}