Feedback regulation of polyamine biosynthesis: a characterization at the molecular level

Abstract

The polyamines putrescine, spermidine and spermine are essential for cell growth and differentiation. The biosynthesis of polyamines are tightly regulated by feedback mechanisms involving two enzymes, namely ornithine decarboxylase (ODC) and S-adenosylmethionine decarboxylase (AdoMetDC). This thesis deals with the mechanisms behind the polyamine-mediated feedback control of these enzymes. The polyamines were found to regulate ODC at a translational level. Depletion of cellular polyamines resulted in an increase in the ODC synthesis, which was not explained by a change in the amount of ODC mRNA. AdoMetDC, on the other hand, was demonstrated to be regulated by polyamines at two different levels, namely by changes in the transcription/stability of the AdoMetDC mRNA as well as in the translational efficiency of the mRNA. Polyamine depletion induced an increase in AdoMetDC synthesis rate which was much larger than that of the AdoMetDC mRNA content. The translational control of AdoMetDC expression was found to be dependent on the presence of the unusually long GC rich 5´ untranslated region in the AdoMetDC mRNA. AdoMetDC has earlier been shown to be synthesized as a proenzyme, which then is converted into the two subunits of the active enzyme. Evidence was obtained in the present thesis that putrescine stimulates this process in vivo. It was furthermore demonstrated that the very rapid turnover of AdoMetDC may be affected by inhibitors of polyamine metabolism. Aminoguanidine, which is frequently used in cellular systems to inhibit any degradation of polyamines by a serum amine oxidase, was shown to apparently inhibit AdoMetDC by an irreversible mechanism which markedly stabilized the enzyme against proteolytic degradation. To obtain information on structures essential for the feedback control of ODC as well as for the rapid degradation of the enzyme, the ODC gene from the insect trypanosome C. fasciculata was cloned and characterized. C. fasciculata ODC is so far the only known parasite ODC with a rapid turnover. The protein, which had a 40% homology to mammalian ODC, was found to lack a carboxyterminal degradation domain generally believed to be necessary for the rapid turnover of the enzyme. Nevertheless, it was shown to retain its rapid turnover even when expressed in a mammalian system, indicating the presence of another degradation domain.

Abstract (Swedish)

Popular Abstract in Swedish

Två av de viktigaste polyaminerna påträffades redan i slutet av 1600-talet, som kristaller i tjursperma och har därför fått namnen spermin och spermidin. Dessa aminer bildas från en annan substans, putrescin, som först isolerades från ruttnande kött. Namnet putrescin kommer från engelskans putrefaction, som betyder förruttnelse. Polyaminer, som kemiskt sett är positivt laddade organiska föreningar, återfinns i alla organismer från bakterier till däggdjur. Trots att dessa substanser har studerats intensivt har man ännu inte kunnat fastställa vad deras exakta funktioner är i cellen. Polyaminerna har dock visat sig vara nödvändiga för cellers tillväxt. På senare tid har det också kommit tecken att de har betydelse för kommunikationen mellan nervceller i det centrala nervsystemet.



Nivåerna av polyaminer i en cell är mycket hårt kontrollerade och det är i huvudsak två enzymer, ornitindekarboxylas (ODC) och S- adenosylmetionindekarboxylas (AdoMetDC), som styr bildningen av polyaminer. Halterna av dessa enzymer är normalt mycket låga i vilande celler, men ökar snabbt då cellerna börjar dela sig. Ett flertal hämmare av dessa båda enzymer har tagits fram. Om ett eller båda av dessa enzymer hämmas bildas inte några polyaminer och då cellernas förråd av polyaminer är slut slutar också cellerna att dela sig. Tumörceller delar sig snabbt och är därför beroende av en hög polyaminbildning. På grund av kopplingen mellan celltillväxt och polyaminer har flera av dessa hämmare testats för behandling av olika tumörsjukdomar. Odlade tumörceller är mycket känsliga för polyaminsyntes- hämmarna, emedan tumören hos en cancerpatient oftast inte svarar lika bra på denna typ av behandling. Ett undantag är en speciell form av hjärntumör, s.k. gliom, där effekten är mycket god. Detta är glädjande då denna tumörtyp annars är mycket svårbehandlad. Sannolikt beror den måttliga effekten av polyaminsyntes-hämmare på tumörsjukdomar på att både normala celler och tumörceller har mycket effektiva kontrollsystem för att upprätthålla adekvata nivåer av polyaminer i cellen. I denna avhandling karakteriseras de mekanismer som är involverade i cellernas reglering av polyamin-nivåerna. Härvidlag har visats att celler utsatta för hämmare av ODC eller AdoMetDC producerar mer av enzymerna för att ersätta de enzym-molekyler som hämmats. I fallet AdoMetDC sker detta genom att mängden budbärar-molekyler (mRNA), som skrivs av från genen ökar (ökad transkription) samtidigt som produktionen av enzym från varje mRNA molekyl blir effektivare (ökad translation), vilket är ovanligt i högre djur. En ökad transkription är det vanligaste sättet som mängden av ett protein ökas i högre stående organismer som ryggradsdjur. Den ökade bildningen av ODC visades å andra sidan huvudsakligen vara orsakad av en ökad translation. Både ODC och AdoMetDC tillhör en liten grupp av proteiner som har en lång icke-kodande del i början av sitt mRNA. Till denna grupp hör huvudsakligen proteiner som är involverade i cellens tillväxt. I avhandlingen visades att den icke-kodande delen av AdoMetDC mRNAt har en reglerande funktion och avsaknad av denna del av mRNAt resulterar i en förlust i polyaminernas förmåga att styra tillverkningen av enzym från detta mRNA.



Afrikansk sömnsjuka (trypanosomiasis) orsakas av en encellig parasit, Trypanosoma brucei, som sprids av Tsetseflugan. Slutstadiet av sjukdomen, med spridning av parasiten in till det centrala nervsystemet, har en dödlighet på upp emot 100%. Man räknar med att cirka 300 000 människor avlider i denna sjukdom årligen. Hämning av polyaminbildningen har visat sig vara en mycket effektiv behandlingsform av sömnsjuka. Denna behandling botar i stort sett alla patienter även de med parasiter i centrala nervsystemet. I Syd- och Mellanamerika förekommer en sjukdom, Chagas sjukdom, som orsakas av parasiten Trypanosoma cruzi. Denna parasit, som är en släkting till T. brucei, sprids av en blodsugande skinnbagge. Parasiten lever inne i perifera nervceller och muskelceller, som då långsamt förstörs. Sjukdomen leder till att hjärtat så småningom sviktar samt att tarmarna slutar att fungera. Denna sjukdom har ett mycket långsammare förlopp än afrikansk sömnsjuka med en gradvis tilltagande invaliditet som ofta leder till en för tidig död. Uppskattningsvis är 16-18 miljoner människor smittade av parasiten och än idag finns det inga effektiva läkemedel mot denna sjukdom. Det sista arbetet i avhandlingen handlar om isoleringen och karakteriseringen av genen för ODC från en släkting till T. brucei och T. cruzi, nämligen Crithidia fasciculata. Denna organism smittar inte människor utan använder istället enbart insekter som värddjur. Då den dessutom är lätt att odla används den ofta i forskningen som modellorganism för sina sjukdomsframkallande släktingar. Kunskaper om strukturen på ODC proteinet i C. fasciculata skulle kunna användas i syfte att få fram mera effektiva hämmare av enzymet ODC i trypanosomer. ODC från C. fasciculata visade sig ha flera unika egenskaper. Det har en lika snabb biologisk omsättning som ODC i däggdjur, vilket skiljer det från alla andra kända parasiters ODC. Efter att ha bestämt sekvensen av ODC-genen hos C. fasciculata fann vi att denna saknade en viktig del, som hittills ansetts nödvändig för den snabba biologiska omsättningen av ODC. Genom att föra in genen i en däggdjurscell kunde vi visa att enzymet bibehöll sina snabba omsättning även i denna typ av celler trots att det saknade den del som ansetts vara nödvändig för detta.

• author: Svensson, Fredrik
• supervisor: [unknown] [unknown]
• opponent: Berger, Franklin G., Department of Biological Sciences, University of South Carolina, Columbia, South Carolina, USA
• publishing date: 1996
• type: Thesis
• publication status: published
• subject: Developmental Biology
• keywords: Fysiologi, polyamine/ornithine decarboxylase/S-adenosylmethionine decarboxylase/protein turnover/PEST region/Crithidia fasciculata/translational control/molecular cloning, Physiology, Biochemistry, Metabolism, Biokemi, metabolism
• pages: 57 pages
• defense location: Segerfalksalen, Wallenberg Neuroscience Center, Sölvegatan 17, Lund
• defense date: 1996-09-14 09:15:00
• external identifiers: other:ISRN: LUMEDW/MEFN--02--SE
• ISBN: 91-628-2142-3
• language: English
• LU publication?: no
• additional info: The information about affiliations in this record was updated in December 2015. The record was previously connected to the following departments: Molecular and Cellular Physiology (ceased) (LUR000011)
• id: 96b9340e-f5b1-4a1b-a6eb-91c4bf390d35 (old id 28592)
• date added to LUP: 2016-04-04 11:26:46
• date last changed: 2018-11-21 21:04:55