Advanced

Affinity Precipitation of Proteins. Characterization of Some Underlying Mechanisms

Linné Larsson, Eva (1996)
Abstract (Swedish)
Popular Abstract in Swedish

Många av dagens biotekniska processer syftar till att framställa protein. Det är proteinets användningsområde som är avgörande för vilka renhetskrav som ställs på produkten. I vissa fall måste proteinet vara helt fritt från föroreningar för att inte åstadkomma oönskade effekter. Vaccinframställning är ett exempel på en sådan tillämpning. För andra ändamål, t ex vid framtagning av enzym för tvättmedelsindustrin är en lägre kvalitet tillräcklig.



Den biotekniker som har till uppgift att rena fram ett visst protein kan välja mellan många olika tekniker. Det är av största vikt att hitta en så snabb coh enkel metod som möjligt, ty med en sådan uppnås två viktiga mål, nämligen en... (More)
Popular Abstract in Swedish

Många av dagens biotekniska processer syftar till att framställa protein. Det är proteinets användningsområde som är avgörande för vilka renhetskrav som ställs på produkten. I vissa fall måste proteinet vara helt fritt från föroreningar för att inte åstadkomma oönskade effekter. Vaccinframställning är ett exempel på en sådan tillämpning. För andra ändamål, t ex vid framtagning av enzym för tvättmedelsindustrin är en lägre kvalitet tillräcklig.



Den biotekniker som har till uppgift att rena fram ett visst protein kan välja mellan många olika tekniker. Det är av största vikt att hitta en så snabb coh enkel metod som möjligt, ty med en sådan uppnås två viktiga mål, nämligen en minskad risk för nedbrytning av de känsliga proteinmolekylerna och en god processekonomi. För att möta marknadens ökade behov av renade proteiner läggs stora forskningsinsatser ner på proteinreningsområdet, med avsikt att förbättra de befintliga metoderna och att finna nya och bättre tekniska lösningar.



Det har varit känt sedan länge att proteiner i lösning kan fällas ut. Denna kunskap utnyttjades redan vid tiden kring andra världskriget, då proteiner ur blodplasma började isoleras med hjälp av fällning. Aminosyrorna som är proteinernas byggstenar har olika kemisk natur. Vissa bär t ex en positiv laddning medan andra är negativt laddade. Eftersom alla proteinier har en speciell sammansättning av aminosyror kommer deras ytor att markant skilja sig åt. Detta faktum utnyttjas i fällningsprocessen där ämnen som påverkar ytan hos proteinerna tillsätts (exempelvis salt och organiska lösningsmedel). De proteiner som inte trivs i den nya miljön faller ut medan de andra förblir i lösning.



Förmågan hos vissa proteiner att binda till speciella molekyler har utnyttjats under de senaste åren för att utarbeta mer sofistikerade fällningmetoder. Enzymer som binder ett substrat vilket omvandlas till en produkt är ett av många exemple på bindingsreaktioner som används i detta syfte. Den här igenkänningsmekanismen eller affinitetsinteraktionen som den också kallas utnyttjas ofta i proteinreningssammanhang. Detta arbete omfattar studier av proteinfällningsmetoder baserade på sådan binding, sk affinitetsfällningar. De kan i korthet beskrivas enligt följande: Affinitetsinteraktionen mellan målproteinet och en polymer sker i lösningen. De bildade komplexen fälls ut i nästa steg. Kvar i lösningen finns då de proteiner som inte bundit till polymeren. Fällningen tvättas noggrant och därefter bryts bindingen mellan målproteinet och polymeren varvid ett renat protein erhålles.



Avsikten med den här studien var att få en ökad förståelse för utgången av hela processen. Sockerinnehållande polymerer har bl a använts för att rena fram Concanavalin A och sojaböns lektin, som båda är sockerbindande proteiner. I ett annat system isolerades enzymet trypsin med en polymer till vilken ett substratliknande ämne hade bundits. Olika analysmetoder har använts för att i detalj undersöka affinitetsinteraktionerna, uppbyggandet av fällningarna och frisättningen av de önskade proteinerna. Med hjälp av de presenterade resultaten kommer förhoppningsvis optimeringar av fällningsprocesser att underlättas i framtiden. De utnyttjade metoderna kan dessutom användas då förundersökningar av nya fällningssystem skall ske. (Less)
Abstract
Two polymers, alginate and Eudragit S-100 were used as reversibly soluble-insoluble ligand carriers for the selective isolation of enzymes and lectins respectively. These two polymers have the inherent property of being precipitated under well defined conditions. Alginate was made insoluble by the addition of Ca2+ ions, and Eudragit S-100 by a pH shift. The polymers were modified with affinity ligands before they could be used for specific recognition of target proteins in affinity precipitation processes.



The final result of an affinity precipitation procedure is determined by several underlying mechanisms of which a few were investigated. The initial complex formation between the polymer-ligands and the proteins of... (More)
Two polymers, alginate and Eudragit S-100 were used as reversibly soluble-insoluble ligand carriers for the selective isolation of enzymes and lectins respectively. These two polymers have the inherent property of being precipitated under well defined conditions. Alginate was made insoluble by the addition of Ca2+ ions, and Eudragit S-100 by a pH shift. The polymers were modified with affinity ligands before they could be used for specific recognition of target proteins in affinity precipitation processes.



The final result of an affinity precipitation procedure is determined by several underlying mechanisms of which a few were investigated. The initial complex formation between the polymer-ligands and the proteins of interest was studied using dynamic laser light scattering (DLLS). The ligand to target protein ratio was found to be a cruical parameter when the lectin Concanavalin A (Con A) was reacted with p-aminophenyl-a-D-glucopyranoside modified Eudragit S-100. An optimal ratio of 40 ligands (corresponding to 0.5 polymer molecules) per lectin resulted in a maximal initial rate of complex formation. The complex build-up between endo-polygalacturonase and alginate was also determined in a similar way during progress of precipitation. Rheological measurements were used to study the behavior of Eudragit S-100 in solution as well as in a precipitated state. The relatively strong intermolecular network dominated by hydrophobic interactions was broken down as the polymer was modified with affinity ligands. The same tendency was observed for unmodified Eudragit S-100 in the presence of NaCl or protein. Elution from a resolubilized polymer was found to be superior as compared to the recovery of target protein directly from a precipitate. DLLS was used to study the kinetics of the elution of Con A from p-aminophenyl-a-D-glucopyranoside modified Eudragit S-100, initiated by the addition of low molecular weight sugars. The dissociation process followed a simple first order reaction in all cases.



The efficiency of an affinity precipitation process for soybean hemagglutinin (SBH) based on Eudragit S-100 was compared with an affinity chromatographic procedure. The yield of SBH from an affinity column was three times higher than the yield from affinity precipitation. Precipitation of SBH was done from protein extracts pretreated to different degrees. A more precessed starting material resulted in a purer product at the expense of yield. (Less)
Please use this url to cite or link to this publication:
author
opponent
  • Prof. Jansson, Jan-Christer, Separationscentralen, BMC, Uppsala universitet
publishing date
type
Thesis
publication status
published
subject
keywords
Purification, Proteins, Lectins, Eudragit S-100, Enzymes, Dynamic laser light scattering, Concanavalin A, Complex dissociation, Complex formation, Affinity precipitation, Alginate, Reversibly soluble-insoluble polymers, Rheology, Soya bean hemagglutinin, Biotechnology, Bioteknik
pages
57 pages
publisher
Eva Linné Larsson, Department of Biotechnology, Center for Chemistry and Chemical Engineering, P. O. Box 124, S-221 00 Lund, Sweden
defense location
Chemical Center (hall K:B)
defense date
1996-09-27 10:15
external identifiers
  • other:ISRN: LUKDH/TKBT--96/1030--S
language
English
LU publication?
no
id
3f10a002-4708-4ffd-8ac5-ecff32c5691f (old id 28699)
date added to LUP
2007-06-14 09:44:29
date last changed
2016-09-19 08:45:07
@phdthesis{3f10a002-4708-4ffd-8ac5-ecff32c5691f,
  abstract     = {Two polymers, alginate and Eudragit S-100 were used as reversibly soluble-insoluble ligand carriers for the selective isolation of enzymes and lectins respectively. These two polymers have the inherent property of being precipitated under well defined conditions. Alginate was made insoluble by the addition of Ca2+ ions, and Eudragit S-100 by a pH shift. The polymers were modified with affinity ligands before they could be used for specific recognition of target proteins in affinity precipitation processes.<br/><br>
<br/><br>
The final result of an affinity precipitation procedure is determined by several underlying mechanisms of which a few were investigated. The initial complex formation between the polymer-ligands and the proteins of interest was studied using dynamic laser light scattering (DLLS). The ligand to target protein ratio was found to be a cruical parameter when the lectin Concanavalin A (Con A) was reacted with p-aminophenyl-a-D-glucopyranoside modified Eudragit S-100. An optimal ratio of 40 ligands (corresponding to 0.5 polymer molecules) per lectin resulted in a maximal initial rate of complex formation. The complex build-up between endo-polygalacturonase and alginate was also determined in a similar way during progress of precipitation. Rheological measurements were used to study the behavior of Eudragit S-100 in solution as well as in a precipitated state. The relatively strong intermolecular network dominated by hydrophobic interactions was broken down as the polymer was modified with affinity ligands. The same tendency was observed for unmodified Eudragit S-100 in the presence of NaCl or protein. Elution from a resolubilized polymer was found to be superior as compared to the recovery of target protein directly from a precipitate. DLLS was used to study the kinetics of the elution of Con A from p-aminophenyl-a-D-glucopyranoside modified Eudragit S-100, initiated by the addition of low molecular weight sugars. The dissociation process followed a simple first order reaction in all cases.<br/><br>
<br/><br>
The efficiency of an affinity precipitation process for soybean hemagglutinin (SBH) based on Eudragit S-100 was compared with an affinity chromatographic procedure. The yield of SBH from an affinity column was three times higher than the yield from affinity precipitation. Precipitation of SBH was done from protein extracts pretreated to different degrees. A more precessed starting material resulted in a purer product at the expense of yield.},
  author       = {Linné Larsson, Eva},
  keyword      = {Purification,Proteins,Lectins,Eudragit S-100,Enzymes,Dynamic laser light scattering,Concanavalin A,Complex dissociation,Complex formation,Affinity precipitation,Alginate,Reversibly soluble-insoluble polymers,Rheology,Soya bean hemagglutinin,Biotechnology,Bioteknik},
  language     = {eng},
  pages        = {57},
  publisher    = {Eva Linné Larsson, Department of Biotechnology, Center for Chemistry and Chemical Engineering, P. O. Box 124, S-221 00 Lund, Sweden},
  title        = {Affinity Precipitation of Proteins. Characterization of Some Underlying Mechanisms},
  year         = {1996},
}