C4b-binding protein : studies on its interactions with C4b, protein S and serum amyloid P component

Abstract

C4b-binding protein (C4BP) is an acute-phase plasma glycoprotein which regulates the complement system through its affinity for C4b. In addition, C4BP binds to the anticoagulant protein S and to serum amyloid P component (SAP). Protein S is a vitamin K-dependent protein which looses its anticoagulant properties when binding to C4BP. C4BP is composed of two types of subunits, the a-chain and the b-chain. The major form of C4BP in human plasma is composed of eight disulphide-linked chains, seven a-chains and one b-chain, whereas a minor portion lacks the b-chain. Both types of chains contain internally homologous repeats called short consensus repeats (SCRs).



The aim of this work has been to study the structure-function relationship of C4BP. By constructing cDNA clones encoding various truncated or chimeric C4BP molecules and expressing these recombinant proteins in either bacterias or mammalian cells, we have been able to localise regions involved in the interactions between C4BP and its ligands. We found that the amino-terminal SCR, SCR1, of the a-chain is crucial for the C4b binding and factor I-cofactor function of C4BP whereas neither the b-chain nor the N-linked carbohydrates are involved. The entire binding site for protein S was found to be contained within SCR1 of the C4BP b-chain and not to involve the N-linked carbohydrates. The binding site for SAP was localised to the central core fragment (SCR8 and the carboxy-terminal region of the a-chains) obtained after digestion of C4BP by chymotrypsin. Removal of the N-linked carbohydrates of C4BP led to a lower affinity for SAP. Furthermore, we have developed an immunological assay for the determination of the concentration of b-chain-containing forms of C4BP. Using this assay, we found that it is mainly the concentration of the form of C4BP without the b-chain that increases during the acute phase which suggests the expression of the a- and b-chains to be differentially regulated during the acute-phase response thereby ensuring a stable level of free anticoagulant active protein S. Finally, we have shown that polymerisation of C4BP is independent of the b-chain, the N-linked carbohydrates and of the three most amino-terminal SCRs of the a-chain.

Abstract (Swedish)

Popular Abstract in Swedish

C4b-bindande protein (C4BP) är involverat i regleringen av två kaskadliknande system, komplementsystemet och koagulationssystemet. Komplementsystemet har fått sitt namn av att det kompletterar antikropparna i immunförsvaret. Det består av en serie reaktioner som leder till oskadliggörandet av bakterier och andra mikroorganismer. Genom sin förmåga att binda till och inaktivera komplementproteinet C4b kontrollerar C4BP ett av nyckelenzymerna i komplementsystemet och bidrar därmed till att förhindra att de kroppsegna cellerna skadas. Även koagulationssystemet består av en serie enzymatiska reaktioner. Det initieras efter en vävnadsskada och leder till bildandet av ett blodkoagel. Ett av reglerproteinerna i denna kaskad är antikoagulationsproteinet protein S. I human plasma är det mesta av protein S bundet till C4BP, och eftersom det bara är fritt protein S som kan hämma koagulationssystemet, har C4BP en reglerande funktion också i denna kaskad. C4BP binder dessutom till serum amyloid P komponent (SAP), ett protein med okänd funktion som bl.a. binder till s.k. amyloidfibriller, vilka t. ex. inlagras i hjärnan vid Alzheimers sjukdom och Downs syndrom. C4BP består av två olika sorters subenheter, a-kedjan och b-kedjan. I human plasma finns olika former av C4BP. Den vanligaste formen innehåller sju a-kedjor och en b-kedja, medan det också finns C4BP varianter utan b-kedja. Både a- och b-kedjan är uppbyggda av likartade moduler, s.k. SCRs (short consensus repeats). a-kedjan innehåller åtta sådana moduler, var och en ungefär 60 aminosyror lång, medan b-kedjan innehåller tre. Kedjorna sitter ihop i den ena änden (den s.k. karboxyterminala änden), vilket gör att C4BP molekylen ser ut som en bläckfisk med långa flexibla tentakler.



Denna avhandling innehåller sex stycken vetenskapliga uppsatser som alla handlar om sambandet mellan struktur och funktion hos C4BP. Vi har lokaliserat regioner av C4BP som är involverade vid bindningen av C4b, protein S och SAP. Dessutom har vi studerat sambandet mellan förhöjda plasmakoncentrationer av C4BP och koncentrationerna av de olika formerna av protein S (fritt och bundet). Struktur/funktionsstudier är viktiga för att vi bättre ska förstå vad som händer när proteiner binder till varandra, och på sikt kan dessa kunskaper leda till framtagandet av rekombinanta ("konstgjorda") proteiner för terapeutiskt ändamål.



C4BP-protein S: I det första delarbetet framställdes ett rekombinant protein bestående av de tre SCR-modulerna av b-kedjan. Detta protein band till protein S med hög affinitet och kunde fullständigt förtränga bindningen av protein S till C4BP renat från plasma. Detta visade att bindningsstället för protein S är lokaliserat till b-kedjans tre SCR-moduler. I arbete II framställdes på samma sätt två olika rekombinanta proteiner, ett bestående av b-kedjans SCR1 + SCR2 och ett av SCR2 + SCR3. Bindningsstudier med dessa proteiner visade att SCR1 + SCR2 innehöll det protein S-bindande stället. För att ytterligare kunna definiera vilken region som är involverad i bindningen av protein S, framställdes tre rekombinanta proteiner bestående av C4BP a-kedjor med SCR1, SCR1 + SCR2 eller SCR1 + SCR2 + SCR3 utbytta mot motsvarande regioner från b-kedjan. Alla tre proteinerna band till protein S med lika hög affinitet som C4BP renat från plasma. Detta visade att b-kedjans SCR1 innehåller hela bindningsstället för protein S.



C4BP-C4b: I delarbete IV framställdes och karakteriserades rekombinant C4BP bestående enbart av a-kedjor. Detta var uppbyggt av av sju eller åtta a-kedjor och hade samma C4b-bindande egenskaper som C4BP renat från plasma, medan det inte band till protein S vilket visade att b-kedjan inte behövs vare sig för polymerisering av a-kedjorna eller för bindningen till C4b, men att den är oumbärlig för bindning av protein S. För att studera betydelsen av a-kedjans N-kopplade kolhydrater (d.v.s. de kolhydrater som är kopplade till aminosyran aspargin) syntetiserades en del av proteinet utan dessa, och vi fann att C4BP utan N-kopplade kolhydrater band C4b med samma affinitet som C4BP med kolhydrater, vilket visade att dessa ej är involverade i bindningen till C4b. För att lokalisera delar av a-kedjan involverade i C4b-bindningen användes i delarbete V en serie monoklonala antikroppar och tre av de rekombinanta proteinerna karakteriserade i delarbete II (se ovan). Resultaten visade att a-kedjans första SCR (räknat från den s.k. aminoterminala änden), SCR1, är oumbärlig för att C4BP ska binda till C4b.



C4BP-SAP: I delarbete VI studerades bindningen av SAP till C4BP. Genom att enzymatiskt klyva C4BP erhölls två fragment, ett bestående av större delen av a-kedjorna (SCR1 - SCR7) och ett bestående av ihopkopplade rester av a-kedjorna. Det senare fragmentet band SAP med hög affinitet, medan SCR1 - SCR7 inte band. Eftersom SAP är ett kolhydratbindande protein, testades också de rekombinanta proteinerna med och utan N-kopplade kolhydrater som beskrevs i delarbete IV. SAP band till båda proteinerna men med lägre affinitet till det utan kolhydrater. Detta visade att SAP binder till den centrala regionen av C4BP och att a-kedjans N-kopplade kolhydrater är involverade men att ytterligare regioner är viktiga för full bindning.



Delarbete III behandlar regleringen av a- och b-kedjorna. C4BP är ett akutfasprotein d.v.s. vid en inflammatorisk reaktion ökar dess plasmakoncentration. Vi mätte koncentrationen av de olika C4BP-formerna (med och utan b-kedja) och de olika formerna av protein S (fritt och bundet) hos patienter under akutfas och fann att det framförallt var C4BP formen utan b-kedja som ökade, vilket ledde till att koncentrationen av fritt protein S förblev normal. Låga koncentrationer av fritt protein S är en riskfaktor för tromboemboliska sjukdomar. Genom en differentierad reglering av C4BP a- och b-kedjorna möjliggörs en stabil nivå av fritt protein S även då koncentrationen av totalt C4BP stiger.

• author: Härdig, Ylva
• supervisor: [unknown] [unknown]
• opponent: Docent Johansson, Staffan, Institutionen för Medicinsk och Fysiologisk Kemi, BMC, Uppsala, Sverige
• publishing date: 1996
• type: Thesis
• publication status: published
• subject: Pharmacology and Toxicology; Medicinal Chemistry
• keywords: Klinisk kemi, Clinical chemistry, coagulation system, complement system, serum amyloid P component, C4b, C4b-binding protein, protein S, Immunology, serology, transplantation, Immunologi, serologi
• pages: 136 pages
• defense location: Medical Research Center, MAS
• defense date: 1996-11-09 10:15:00
• external identifiers: other:ISRN: LUMEDW/MECM--1018--SE
• ISBN: 91-628-2201-2
• language: English
• LU publication?: no
• id: 269d2313-de65-4754-ae98-d4723d73eae7 (old id 28741)
• date added to LUP: 2016-04-04 11:38:02
• date last changed: 2018-11-21 21:06:08