Experimental Vitreous Substitution

Abstract

Blindness and visual disability are common following vitreoretinal pathologies such as open globe injury, proliferative diabetic retinopathy, and rhegmatogenous retinal detachment (RRD). These conditions often necessitate surgical intervention using vitrectomy with a tamponading vitreous substitute. However, current tamponades are all associated with complications such as inflammation, cataract, glaucoma, and optic nerve atrophy. Translation of new vitreous substitutes into clinical use has proven to be challenging, due to a lack of a comprehensive methodology and numerous requirements; bio-compatibility and clinical.
In this thesis, we explore several novel vitreous substitutes using newly developed methods with the ultimate goal of clinical translation.
First, in an in vitro adult rat retinal explant culture assay, polyethylene glycol, and Bio-Alcamid® gels provoked retinal degeneration, while a cross-linked hyaluronic acid hydrogel, Healaflow®, matched, and even surpassed the preservation of structure when compared with medium only. Secondly, Healaflow® used as a vitreous substitute in an in vivo rabbit vitrectomy model revealed practical usability and favorable bio- compatibility. In a third study, vitreous substitutes with disparate biocompatibility profiles (silicone oil, Healaflow®, Bio-Alcamid®, and BSS) elicited different patterns of intrinsic and extrinsic retinal inflammation in vivo. Finally, a new rabbit repeat vitrectomy RRD-model revealed excellent tamponading effect of the Healaflow® gel.
The combination of the presented in vivo and in vitro methods comprise a new paradigm in translational development of novel vitreous substitutes. Healaflow® stands out as a promising candidate for future clinical use as a vitreous substitute.

Abstract (Swedish)

Blixtar. Svarta prickar, spindelben och dimmoln. Rörliga grumlingar framför ögat och liknade symptom drabbar varje dag många svenskar. Oftast är symptomen helt ofarliga men de kan också tyda på begynnande näthinneavlossning, vilket i värsta fall kan leda till blindhet.
Näthinneavlossning börjar i de flesta fall med en s.k glaskroppsavlossning. Detta tillstånd innebär att glaskroppen, den geléartade massa som fyller det inre av ögat, börjar skrumpna och släppa från näthinnan. Det är en åldersrelaterad process som kan vara oroväckande men oftast är helt ofarlig. Glaskroppen sitter normalt sett relativt löst fäst vid näthinnan, men om dragningen mot näthinnan blir för kraftig eller om det finns svagheter i denna, kan det uppstå hål eller större revor. Genom dessa kan vätska tränga in som i sin tur kan lösgöra näthinnan från underlaget, en näthinne- avlossning. Om detta uppstår, får man i regel ännu mera framträdande och oroande symptom än vid enbart glaskroppsavlossning; synbortfall i form av mörka skuggor som gradvis blir större och till slut suddig syn. Normalt sett är det enda sättet att bota näthinneavlossning operation, vilken måste utföras relativt snabbt för att förhindra allvarliga synhandikapp eller t.o.m. blindhet.
Vitrektomi är en av de vanligaste operationsmetoderna vid näthinneavlossning och andra tillstånd som t.ex efter allvarligt trauma och diabeteskomplikationer. Denna operationsmetod innebär att man klipper och suger ut glaskroppen med små instru- ment, varvid draget mot näthinnan kan avlägsnas. För att täppa till, tamponera, eventuella hål i näthinnan och underlätta läkningsprocessen används oftast special- utvecklade gaser som så småningom försvinner av sig själv och ersätts av kroppsegen vätska. I svåra fall kan även silikonolja användas, vilken måste avlägsnas efter en tid. Både gaserna och oljan har avsevärda nackdelar; under behandlingstiden är synen alltid kraftigt nedsatt och behandlingen är förenad med biverkningar i form av inflammation, grå starr, tryckstegringar, toxisk påvekan på näthinnan och förtvining av synnerven. Dessutom måste man med dessa tamponader ofta för att få optimal effekt hålla huvudet i obekväma lägen under en viss del av behandlingstiden.
För att förbättra både läkning och minska biverkningarna har man under lång tid försökt utveckla nya, bättre sätt att ersätta glaskroppen på, men hittills har inget alternativ lyckats. Man skulle kunna tro att glaskroppen, som även ögonläkare ofta brukar se som en okomplicerad gelé, borde vara relativt enkel att efterlikna, men så tycks inte vara fallet. I själva verket är glaskroppens struktur mycket specifik och dess fysiologiska påverkan på ögats övriga vävnader komplex. Studier har visat att glas- kroppen är viktig för ett flertal normala funktioner, bland annat genom att upp- rätthålla den viktiga mikromiljön i ögat. Exempelvis ökar risken för gråstarr om denna miljö rubbas, såsom efter en vitrektomi. Glaskroppens struktur är en så kallad hydrogel som huvudsakligen består av vatten, hyaluronsyra och ett nätverk av kollagenfibrer som likt armeringsjärn skapar stadga. Hyaluronsyra är känt för att vara skonsamt mot kroppen; t.ex. har preparat i gel-form, ursprungligen utvunna ur tupp- kammar, länge använts inom gråstarr-kirurgi och för att lindra artros i leder.
Svårigheten med att hitta en välfungerande ersättning för ögats naturliga glaskropp, ett glaskroppssubstitut, härrör från glaskroppens komplexa samspel med ögats inre i kombination med den långa lista av andra önskvärda egenskaper som man kan upp- rätta; till exempel måste preparatet vara skonsamt mot näthinnan, vara möjligt att föra in i ögat under operationen och inte störa synen med grumligheter eller besvä- rande brytningsindex. För att efterlikna den naturliga glaskroppen har vi därför under hela det projekt som ligger till grund för denna avhandling utvärderat ett preparat, Healaflow®, som består av hyaluronsyra där molekylerna på artificiell väg samman- länkats, korsbundits.
Förutom ovan nämnda svårigheter, har det tidigare funnits luckor i processen för att utveckla och föra över nya lovande glaskroppssubstitut från laboratoriet till kliniken – den så kallat translationella processen. Traditionellt sett har man först analyserat nya substanser kemiskt och fysikaliskt samt utfört toxikologiska försök på enskilda celler. Därefter har man övergått till försök på friska, unga försöksdjur och så småningom till kliniska studier på patienter. De stora hopp i den translationella processen som dessa steg inneburit, har gjort att viktig information om ögats reaktioner på den undersökta substansen missats. Detta kan vara en av förklaringarna till att vi ännu inte har någon bättre tamponad att tillgå än gas och olja.
Den viktigaste vävnad som glaskroppen interagerar med är näthinnan. Denna struktur liknar på många sätt hjärnan i sin uppbyggnad och är därmed komplex i sin struktur. Dess samspel med främmande substanser återspeglas inte fullt ut i metoder som baseras på enstaka celler. Av detta skäl utvecklade vi i artikel I en metod för att säkrare bedöma hur skonsamt, biokompatibelt, ett glaskroppssubstitut är för nät- hinnan. Metoden baserar sig på att isolerad vuxen näthinna från råtta exponeras för gelartade substanser i en odlingsmiljö. Näthinnorna kan sedan analyseras mikro- skopiskt och med sk. immunohistokemi. Resultatet från detta försök visade sig stämma väl överens med tidigare fynd som vår grupp gjort i en vitrektomimodell på kanin där påverkan av polyetylenglykol (PEG) och Bio-Alcamid® studerades. I det
aktuella experimentet undersöktes även den korsbundna gelen Healaflow® som be- fanns påverka näthinnan minst och t.o.m skyddade den från patologisk påverkan.
Som ett led i den translationella utvecklingen provade vi också Healaflow® i den tidigare nämnda kanin-vitrektomi modellen, presenterad i artikel II. Gelen kunde lätt användas med sedvanliga kirurgiska metoder och den verkade vare sig påverka näthinnans elektrofysiologi (funktion) eller struktur negativt.
För att gå ännu mer på djupet i hur olika glaskroppssubstitut och vitrektomi i sig själv påverkar näthinnan gick vi sedan vidare med ytterligare försök i kanin-modellen, vilket redogörs för i artikel III. Här ville vi närmare utreda det inflammatoriska svaret i näthinnan efter påverkan av glaskroppssubstitut som tidigare visat olika biokom- patibilitetsprofiler. I detta experiment jämförde vi Healaflow® och Bio-Alcamid® med två av de substanser som idag används i klinisk praxis – saltlösning (BSS) och silikon- olja. Vid immunohistokemiska analyser av ett antal olika inflammatoriska markörer, för såväl näthinnans interna som det cell-baserade externa svaret, fann vi att Healaflow® utlöser ungefär lika lindrig inflammation som vitrektomi där BSS an- vänds, medan både silikonolja och Bio-Alcamid® frammanar ett betydligt kraftigare inflammatoriskt svar i näthinnan.
Som tidigare nämnts brukar man oftast i utvecklingsprocessen av potentiella glaskroppssubstitut gå direkt från försök i friska djurögon till kliniska prövningar. Detta tillvägagångssätt tar t.ex. inte hänsyn till att en avlossad näthinna sannolikt är känsligare och samspelar annorlunda med främmande substanser jämfört med en frisk motsvarighet. Dessutom kan man givetvis inte heller utvärdera någon behandlings- effekt. För att bättre värdera detta samspel och kunna bedöma substansens behand- lingspotential utvecklade vi en ny näthinneavlossningsmodel i kanin, beskriven i artikel IV. I denna skapar vi i samband med vitrektomi först en glaskroppsavlossning, sedan ett hål i näthinnan och till sist en avlossning genom att utföra en mikro- injektion under densamma. Efter minst ett dygn görs en ny vitrektomi då näthinnan läggs på plats och glaskroppssubstitut injiceras. Vi jämförde i denna studie Healaflow® med en av de vanligaste behandlingsmetoderna i kliniken, SF6-gas. Metoden visade sig vara tekniskt något krävande, men klart genomförbart. Studien är av relativt preliminär karaktär, men Healaflow® visade sig i dessa försök ha minst lika god effekt som SF6.
Sammanfattningsvis presenteras här metoder som tillsammans utgör ett nytt translationellt tillvägagångssätt för att utveckla nya glaskroppssubstitut. Vi har med hjälp av detta utvärderat bl.a Healaflow® som visat sig ha stor potential för framtida klinisk användning vid kirurgisk behandling av avancerad näthinnesjukdom.

• author: Barth, Henrik
• supervisor: Fredrik Ghosh; Sven Crafoord
• opponent: professor Hallböök, Finn, Uppsala universitet
• organization: Ophthalmology, Lund; Biomimetic Retinal Tissue Engineering (research group)
• alternative title: Experimentell Glaskroppssubstitution
• publishing date: 2018
• type: Thesis
• publication status: published
• subject: Ophthalmology
• keywords: Retinal Detachment, Vitreous Body : surgery, Retina/cytology/metabolism/surgery, Retina: Function, Retina: Inflammation, Retinal Detachment, Vitreous Body : surgery, Vitreous substitute, Vitrectomy
• in: Lund University, Faculty of Medicine Doctoral Dissertation Series
• volume: 2018
• issue: 146
• pages: 91 pages
• defense location: Lundmarksalen, Astronomihuset, Sölvegatan 27 i Lund
• defense date: 2018-12-14 13:00:00
• ISSN: 1652-8220
• ISBN: 978-91-7619-714-1
• language: English
• LU publication?: yes
• id: 33a32efa-bb3a-473a-a34c-0a0ec38a9a7a
• date added to LUP: 2018-11-05 08:55:14
• date last changed: 2019-11-19 13:49:43