ADP regulation of insulin secretion and beta-cell apoptosis

Abstract

The aims of this dissertation were to investigate the effects of extracellular purines on insulin secretion, and apoptosis in mouse pancreatic islets and β-cells; to examine if high glucose and free fatty acids induces β-cell apoptosis via autocrine effects of ADP acting on the P2Y13 receptor; and to investigate the modulation of extracellular purines in vascular smooth muscle cells (VSMCs) through ectonucleotidase or ATP release under the effect of high glucose.

The expression of the ADP receptors P2Y1 and P2Y13 were shown in both mouse pancreatic islets and isolated β-cells using real-time PCR quantification. Insulin and glucagon secretion were measured both in mouse islets and in vivo. Results showed that ADP acting on P2Y1 receptors stimulated insulin secretion, while acting on P2Y13 receptors inhibited insulin secretion. In MIN6c4 cells, real-time PCR also revealed high expression of the ADP receptors P2Y1 and P2Y13. 2MeSADP induced calcium influx and inhibited cAMP production by activation of P2Y1 and P2Y13 respectively. ELISA and cell proliferation studies showed that 2MeSADP increased Caspase-3 activity and reduced cell proliferation. P2Y13 receptor antagonist MRS2211 could fully reverse both of these effects. Western blotting showed that activation of the cAMP/PKA/CREB pathway resulted in amplification of phosphorylation of Akt/PKB, leading to resistance to apoptosis, increase of β-cell viability and proliferation rate. ATP release in MIN6c4 cells was measured by bioluminescence. High glucose and palmitate potently elevated the extracellular ATP levels. The calcium-channel blocker nifedipine, VRAC-channel inhibitor NPPB, pannexin-1 blocker carbenoxolone, or silencing of MDR1 all resulted in a substantial decrease in high glucose/palmitate induced ATP release. Furthermore, high glucose and palmitate inhibited cAMP production, reduced cell proliferation in MIN6c4 and increased activated Caspase-3 in both mouse islets and MIN6c4 cells and all these effects were dependent on the P2Y13 receptor. Western blotting further showed that blocking the P2Y13 receptor resulted in enhanced CREB, Bad and IRS-1 phosphorylation. Real-time PCR study of ectonucleotidase expression in primary rat aortic VSMCs revealed the expression of CD39, CD39L1 and CD73. 48 hours treatment of high glucose significantly decreased CD39 gene expression and increased CD39L1 expression. Bioluminescence assays also revealed that high glucose caused VSMCs released of ATP and the ectonucleotidase inhibitor ARC67156 led to sustained levels of ATP.

In conclusion, we have shown that activation of the P2Y13 receptor in mouse MIN6c4 cells exhibits a pronounced proapoptotic effect which is mediated by modulating the cAMP/ERKs/CREB/Akt pathway. Autocrine/paracrine effects of ADP acting on the P2Y13 receptor are involved in the proapoptotic effects of high glucose and free fatty acids. P2Y13 antagonist MRS2211, which increased the secretion of insulin and was able to protect the cells from ADP induced apoptosis in β-cells, could be a potential treatment of diabetes. High glucose also increases ATP release from VSMCs and accumulates more ADP by up-regulating the expression of CD39L1, thereby enhance vascular inflammation and VSMC proliferation via P2Y receptor activation.

Abstract (Swedish)

Popular Abstract in Swedish

Endokrina och metabola sjukdomstillstånd har många gemensamma komponenter. Att förstå de signalvägar som ligger till grund för dessa sjukdomar hjälper oss att utveckla bättre behandlingsmetoder. Det övergripande syftet med min forskning är att undersöka den roll s.k. G-protein kopplade receptorer spelar i endokrina metaboliska sjukdomar, mer specifikt de signalvägar som är kopplade till Gα-subenheten. I förlängningen kan detta leda till nya behandlingsmetoder för sjukdomar som påverkar miljontals människor världen över.



Reglering av insulinutsöndring via ADP

Den första delen av mitt avhandlingsarbete fokuserade på att undersöka effekten av extracellulära puriner på insulinutsöndring från de langerhanska öarna i bukspottkörteln hos möss och i sådana fall huruvida de s.k. P2Y-receptorerna är inblandade. Höga glukoshalter stimulerar utsöndring av extracellulärt ATP från många typer av vävnader och celler. Många studier har visat att ATP spelar en viktig roll för insulinutsöndring, men huruvida ADP också är inblandat har varit en kontroversiell fråga. Anledningen till detta är förmodligen att flera olika typer av purinoreceptorer är inblandade. Vi har nu kunnat visa att glukos stimulerar utsöndring av insulin-reglerande puriner. ADP visade sig ha en dubbel roll i betacellerna, då vi fann att insulinutsöndring stimuleras via P2Y1-receptorer och inhiberas via P2Y13-receptorer. En antagonist till P2Y13-receptorn, MRS2211, ökade glukos-stimulerad insulinutsöndring och minskade glukosnivåerna, vilket tyder på att P2Y13-antagonism skulle kunna vara värdefullt för behandling av type 2 diabetes.



Reglering av β-cell apoptos via ADP

Avhandlingsarbetets andra del har fokuserat på vilken roll de P2-receptorer som binder ADP har för apoptos hos β-celler. Att förhindra celldöd hos β-cellerna är en nödvändig del av behandlingen av diabetes. Puriner och pyrimidiner är viktiga signalmolekyler som påverkar många olika cellulära processer men vilken roll extracellulärt ATP och ADP spelar för apoptos hos β-celler har varit oklart. Vi upptäckte att ADP och P2Y13 spelar en viktig roll för apoptos hos β-celler via aktivering av kaspas-3 och kartlade den signalväg som är inblandad. Genom farmakologiska interventionsstudier kunde vi se att aktivering av P2Y13 orsakade inhibering av ERK1/2 medan aktivering av P2Y1 stimulerade p38, vilket tillsammans leder till en pro-apoptotisk signal. Det är troligt att denna effekt uppkommer på grund av sänkta cAMP-nivåer till följd av P2Y13-medierad Gαi-aktivering. Vidare fann vi att inhibering av P2Y13 ökade ser-133-CREB-fosforylering, vilket är en viktig överlevnadsfaktor hos β-celler. Aktivering av cAMP/PKA/CREB-signalvägen resulterar i en ökad insulin-medierad PI3K-fosforylering av Akt/PKB, vilket leder till ökad resistens mot apoptos. Den ökade viabilitet vi såg hos β-cellerna när vi blockerade P2Y13 kan troligen förklaras delvis med aktivering av Akt. Sammanfattningsvis har vi visat att aktivering av P2Y13-receptorn i en β-cellinje har en betydande pro-apoptotisk effekt via cAMP/ERK/CREB/Akt-signalvägen.



Höga nivåer av glukos/palmitat reglerar β-cell apoptos via autokrina effekter av ADP

I en studie tittade vi på autokrina effekter av ADP på β-cell apoptos via P2Y13. Att glukolipotoxicitet påverkar β-cellfunktion och överlevnad negativt har visats tidigare, men vilka signalvägar som medierar dessa effekter är fortfarande okänt. Vi kunde visa att kalciumkanaler, VRAC-kanaler och proteinet MDR1 är involverade i glukos/palmitat-medierad ATP-frisättning. Höga nivåer av glukos och palmitat inhiberade produktion av cAMP och minskade cellproliferation i MIN6c4-celler och ökade kaspas-3 aktivitet i langerhanska öar från möss via P2Y13. Vidare studier visade att blockering av P2Y13 resulterade i ökad fosforylering av CREB, Bad och IRS-1, en signalväg som sedan tidigare visat sig vara viktig för överlevnad hos β-celler och insulinutsöndring. Dessa fynd visar att ADP spelar en viktig auto- och parakrin roll för β-cell apoptos medierad av höga nivåer av glukos och fria fettsyror via P2Y13. Detta har betydelse för förståelsen av sjukdomsförloppet i diabetes.



Höga glukosnivåer inducerar ATP-frisättning och påverkar uttrycket av ektonukleotidaser i vaskulära glattmuskelceller

Vaskulär dysfunktion är vanligt hos patienter med diabetes och har kopplats till kronisk inflammation och proliferation hos vaskulära glattmuskelceller (VSMC). I nuläget studerar vi hur höga glukosnivåer påverkar ATP-frisättning och ektonukleotidas-uttryck i VSMC. Våra resultat indikerar att inhibering av CD39L1 vid höga glukosnivåer blockerar nedbrytningen av ATP till ADP vilket resulterar i ökade ATP-nivåer. Dessutom orsakar höga glukosnivåer minskat uttryck av CD39 och ökat uttryck av CD39L1. CD39 verkar genom att bryta ned ATP/ADP samt UTP/UDP medan CD39L1-aktivering leder till ackumulering av ADP och UDP. Effekterna av höga glukosnivåer leder därför till en ackumulering av ADP vilket stimulerar proliferation och inflammation hos VSMC.

• author: Tan, Chanyuan
• supervisor: David Erlinge; Björn Olde; Jenny Öhman
• opponent: Novak, Ivana, Department of Biology, University of Copenhagen, Denmark
• organization: Cardiology
• publishing date: 2012
• type: Thesis
• publication status: published
• subject: Cardiac and Cardiovascular Systems
• keywords: P2Y, β-cell, ADP, insulin, apoptosis, autocrine, ectonucleotidase
• in: Lund University Faculty of Medicine Doctoral Dissertation Series
• volume: 2012:66
• pages: 85 pages
• defense location: Segerfalksalen, BMC, Lund.
• defense date: 2012-09-25 09:15:00
• ISSN: 1652-8220
• ISBN: 978-91-87189-29-6
• language: English
• LU publication?: yes
• id: 38833876-3af3-4437-aa74-d1a458350e6e (old id 3049685)
• date added to LUP: 2016-04-01 13:47:51
• date last changed: 2023-04-18 20:28:56