Biophysical Studies of Apolipoprotein A-I_M and a Partitioning study

Abstract

The major part of this thesis deals with the similarities and differences in some biophysical properties of apolipoprotein A-I (apo A-I) and the molecular variant apolipoprotein A-I_Milano (apo A-I_M), and the influence on lipid binding. A model compound partitioning study has also been performed. Methods that have been utilised are CD spectroscopy, calorimetry both isothermal and temperature scanning, and native gel electrophoresis.



Apo A-I is the major protein component in high density lipoproteins (HDL), which are found to be inversely correlated with the occurrence of atherosclerosis. The variant protein, apo A-I_M, forms a disulfide linked homodimer that seems to possess an improved anti-atherogenic effect.



Apo A-I_M was found to have a different thermal and guanidine hydrochloride (guHCl)-induced denaturation behavior in its dimeric form, as compared to the monomer form and to apo A-I. The thermal denaturation process of apo A-I_M proceeds via a transition into an intermediate state that is distinct from the unfolded state. This intermediate state has been assigned to be a molten globular state. This state is stabilized by an increase in ionic strength and exists at 37 °C. Unfolding via a stable intermediate state was also observed during guHCl unfolding.



Apo A-I and monomeric apo A-I_M also seem to melt via an intermediate state, but with the difference that these thermal transitions are not well separated, and occur at higher temperatures. Conclusions to be drawn are that the introduction of a disulfide bridge in apo A-I_M favours the molten globular state over the native state at near physiological temperatures.



The existence of a molten globular state of apo A-I_M may influence the functional properties of the protein compared to apo A-I. Upon lipid binding these proteins form a variety of different sized lipid-protein complexes. At 25 °C, dimeric apo A-I_M and apo A-I give similar heterogeneous mixtures of HDL-like complexes (rHDL) when incubated with dimyristoylphosphatidylcholine (DMPC). However at 40 °C, apo A-I_M was shown to form smaller, more homogeneous complexes than apo A-I. This observation suggests that the HDL particle formation depends not only on the thermal behaviour of the lipid but also of the protein.



In addition to the protein studies, the partitioning of 1-hexanol into DMPC vesicles was studied and was found to be more favourable than partitioning into bulk hydrocarbon. This suggests that the use of a membrane model might be more appropriate to evaluate the partitioning properties of a drug. However, there is a need for defining a standard membrane model where vesicle size and lamellarity in addition to the type of lipid, lipid phase and equilibration time is carefully controlled, since these factors affect the partitioning behaviour.

Abstract (Swedish)

Popular Abstract in Swedish

<i>Kursiverade ord förklaras i ordlistan</i>



Ateroskleros (åderförkalkning) är en mycket vanlig sjukdom som börjar i tidig ålder med inlagring av bland annat kolesterol i kärlväggarna (aterosklerotiska plack). Om dessa utvecklas vidare leder det till förträngningar av blodkärlen med hjärt- och kärlsjukdomar som konsekvens. Man pratar om två sorters kolesterol; det goda (HDL) och det onda (LDL). Dessa begrepp rör inte kolesterolmolekylen i sig, utan är de partiklar (lipoproteiner) som transporterar kolesterolet i kroppen. LDL transporterar ut kolesterol till olika delar av kroppen och är det som lagras in i kärlväggarna, medan HDL transporterar kolesterolet från perifer vävnad till levern för utsöndring ut ur kroppen.



HDL är en samling av olika stora komplex mellan <i>lipider</i> och protein. Apolipoprotein A-I (apo A-I) är den främsta proteinkomponenten i dessa komplex. Proteinet kan förekomma både <i>lipid</i>-bundet och i fri form. Låga halter av HDL och apo A-I i blodplasma har samband med förekomst av ateroskleros. Man tror därför att HDL har en skyddande effekt mot ateroskleros.



1980 upptäcktes en variant av apo A-I hos en familj i Italien. Denna variant kom att kallas apolipoprotein A-I_Milano (apo A-I_M). Apo A-I_M har en <i>aminosyra</i> utbytt på ett sätt som gör att två proteinmolekyler kan binda till varandra; man säger att proteinet bildar en <i>dimer</i>. Personer med denna proteinvariant verkar vara skyddade mot ateroskleros. HDL innehållande apo A-I_M istället för normalt apo A-I verkar därmed vara bättre på att transportera bort kolesterol från perifer vävnad.



I vissa djurstudier har man visat att injektioner av HDL kan stoppa utvecklingen och även minska förekomsten av aterosklerotiska plack genom att ta upp inlagrat kolesterol. I och med att HDL som innehåller apo A-I_M verkar effektivare än normalt HDL är det av intresse att eventuellt använda detta som medicinsk behandling av långt gången ateroskleros.



Med hjälp av bakterier kan man på bioteknologisk väg producera apo A-I_M, som sedan blandas med <i>lipider</i> för att få HDL-liknande komplex. Den första studien i denna avhandling handlar om att utvärdera olika reaktionsförhållanden för komplexbildningen. Syftet var att undersöka om man kan styra reaktionen till att ge små homogena HDL (normalt får man en blandning av olika stora HDL). <i>Lipiden</i> dimyristoylfosfatidylkolin (DMPC), både i form av stora (<i>MLV</i>) och små (<i>SUV</i>) <i>liposomer,</i> blandades med apo A-I_M i olika proportioner och vid olika temperaturer. Det visade sig att ett stort överskott av MLV vid 40 ºC, gav ett drygt 90-procentigt utbyte av de minsta HDL med apo A-I_M. Detta kunde inte upprepas med normalt apo A-I, som gav större HDL i flera olika storlekar.



Ett protein är uppbyggt av en lång kedja <i>aminosyror</i> som veckar och packar ihop sig på ett specifikt sätt och ger proteinet dess tredimensionella struktur. Denna struktur är viktig för funktionen av proteinet. Ett fullt veckat protein sägs vara nativt. Genom att ändra temperaturen eller sammansättningen av t.ex. salter i proteinlösningen kan man förändra eller förstöra (smälta) proteinstrukturen. Ett helt uppvecklat protein sägs vara denaturerat. Ett ämne som denaturerar proteiner kallas denatureringsmedel.



Den skillnad mellan apo A-I_M och normalt apo A-I som påvisats i komplexbildningen med lipider, ledde till de tre följande studierna, alla med syftet att undersöka och jämföra denatureringen av proteinerna. Detta gjordes genom att studera proteinet, dels vid temperaturförändringar och dels vid tillsats av ett denatureringsmedel. Det visade sig att apo A-I_M smälte i två distinkta steg till skillnad från normalt apo A-I. Dessa två steg skedde via ett intermediärt tillstånd som varken var nativt eller denaturerat. I detta intermediära tillstånd har proteinet fortfarande en hel del av sin struktur kvar, och det kan innebära att proteinkedjan är mer flexibel än i det nativa tillståndet. Den typ av intermediärt tillstånd som observerades har tidigare setts existera för andra lipidbindande proteiner. Man tror att en ökad flexibilitetet och lösare struktur underlättar själva lipidbindningen. Intermediären existerar vid 37 ºC för apo A-I_M, men inte för normalt apo A-I och skulle därmed kunna förklara en del av den skillnad i HDL- bildning som observerades vid 40 ºC.



Ytterligare en studie gjordes för att utvärdera användning av modell<i>membran</i> för att bestämma <i>fördelningsjämvikter</i> av ett ämne (läkemedel) mellan <i>membranet</i> och en vattenlösning. Denna jämvikt är viktig t.ex. för att kunna förutsäga om, och hur bra, ett läkemedel kommer att tas upp (absorberas) av tarmcellerna. Traditionellt brukar man få ett mått på <i>fördelningsjämvikten</i> genom att mäta fördelningen av läkemedlet mellan en vattenlösning och t.ex. en olja, där oljan representerar det <i>biologiska membranet</i>. Eftersom en olja inte kan jämställas med ett biologiskt membran av flera anledningar, är det av intresse att ta fram olika <i>membran</i>modeller för att uppskatta hur ett läkemedel kommer att absorberas eller i övrigt interagera med <i>biologiska membran</i>. I denna studie visade det sig att modellmembranen uppförde sig olika beroende på om man använde <i>MLV</i> eller <i>SUV</i>. För att kunna använda och jämföra olika <i>fördelningsjämvikter</i> finns det ett behov av att standardisera <i>membranmodellerna</i>.



Liten ordlista:



<i>Aminosyra:</i> Byggsten för proteiner. Det finns 20 olika aminosyror som kan binda till varandra i en lång kedja och bilda proteiner. Ett protein innehåller normalt mellan 50 och 1000 aminosyror. Ordningen av aminosyrorna i proteinkedjan kallas proteinets primärstruktur. När denna kedja sedan veckar sig får proteinet sin tredimensionella struktur.



<i>Biologiska membran:</i> Ett biologiskt membran är en barriär (vägg) mellan olika miljöer. Varje cell i kroppen är omgiven av ett membran. Även inne i cellen är de olika celldelarna omgivna av membran. Biologiska membran är uppbyggda av bl.a. <i>lipider</i>. I membranet kan det ingå olika proteiner.



<i>Dimer:</i> Två sammanlänkade enheter. Monomer är en enhet, dimer är två, trimer är tre o.s.v. Dessa enheter behöver inte vara identiska. Homodimer innebär två lika enheter och heterodimer två olika enheter.



<i>Fördelningsjämvikt:</i> Om man tillsätter ett ämne i en bägare med två i varandra olösliga faser (t.ex. olja och vatten), kommer detta ämne att lösa sig till en viss del i oljan och en viss del i vattnet. De mängder av ämnet man får i respektive fas ger fördelningsjämvikten.



<i>Lipid:</i> Ett samlingsnamn för ämnen (t.ex. fetter) som är olösliga i vatten, men lösliga i organiska lösningsmedel. Vissa lipider är amfifila, vilket innebär att ena änden av molekylen är löslig i vatten. Dessa lipider kommer då i en vattenlösning att orientera sig så att den vattenlösliga delen exponeras för vattnet samtidigt som den skyddar den feta delen från vatten. DMPC är en amfifil lipid, med ett vattenlösligt huvud och två fettsvansar och utgör en av flera byggstenar av biologiska membran. DMPC brukar ofta användas för att göra modeller av biologiska membran.



<i>Liposomer</i>: Strukturer uppbyggda av membranbildande lipider. MLV är uppbyggda av flera allt större sfäriska membran med vatten emellan. Dessa sfärer kan bli väldigt stora (mellan 0.1 och 10 mikrometer). SUV är ett ensamt sfäriskt membran, som är betydligt mindre än MLV (ungefär 0.025 mikrometer). Båda dessa används som modellmembran i olika studier.



<i>MLV:</i> Se liposomer



<i>SUV:</i> Se liposomer

• author: Suurkuusk, Malin
• supervisor: [unknown] [unknown]
• opponent: Dr Murphy, Kenneth P., Department of Biochemistry, University of Iowa
• organization: Biochemistry and Structural Biology
• publishing date: 1999
• type: Thesis
• publication status: published
• subject: Biological Sciences
• keywords: Apolipoprotein A-IMilano, Apolipoprotein A-I, Lipoprotein, Lipid, Microcalorimetry, DCS, Denaturation, Guanidine Hydrochloride, Physics, Fysik, Chemistry, Kemi
• pages: 144 pages
• defense location: Lecture hall D, Chemical Center, Lund
• defense date: 1999-05-17 10:15:00
• external identifiers: other:ISRN: LUNKDL/ (NKTK-15) /144/ (1999)
• ISBN: 91-628-3556-4
• language: English
• LU publication?: yes
• id: d2d5d432-4128-462c-b8b3-5c7dc80d02a0 (old id 39563)
• date added to LUP: 2016-04-04 12:16:39
• date last changed: 2018-11-21 21:10:01