Plasminogen and protein PAM: Interactions between streptococcal surface proteins and the human fibrinolytic system

Abstract

Pathogenic bacteria often produce potent proteases capable of destroying host tissue thereby providing the bacteria with tools for spreading and nutrient access. This thesis describes how group A, C and G streptococci can acquire surface bound protease activity through an alternative mechanism, namely by binding and activation of the human protease precursor plasminogen.



Group A streptococci of certain serotypes (M33, M41, M52, M53 and M56) were found to efficiently bind plasminogen. Similar to a previously described protein (PAM) expressed by a M53 strain, the plasminogen-binding surface proteins of the other four serotypes belonged to the M protein family, known to contain major virulence factors of group A streptococci. In addition, a subset of group C and G streptococci were shown to bind plasminogen through M-like proteins.



In binding experiments with recombinantly produced fragments and a synthetic pepide we located the plasminogen-binding site of protein PAM to a 29 amino acid region containing a twice-repeated sequence. Two lysine residues within this sequence appeared to be critical for the interaction with plasminogen.



The major binding site for PAM to plasminogen was localised to kringle two of human plasminogen. PAM reacted poorly with plasminogen from some other species, including rheusus plasminogen which only differs from the human form in two positions.



PAM-expressing bacteria grown in human plasma acquired surface associated plasmin activiy in spite of the presence of physiological plasmin inhibitors. A chimerical M-like protein, harbouring the plasminogen-binding motif of PAM, transferred this ability to another streptococcal strain. Inactivation of the streptokinase gene abolished surface plasmin acquisition whereas addítion of exogenous streptokinase overcame this block.

Abstract (Swedish)

Popular Abstract in Swedish

Bakgrund



Streptococcus pyogenes, eller grupp A streptokocker, är en av de vanligaste sjukdomsframkallande bakterierna hos människan. De orsakar ofta relativt harmlösa och lättbehandlade ytliga infektioner i hals (halsfluss) och hud (svinkoppor) men kan också ge djupare och livshotande infektioner. Dessutom förekommer följdsjukdomar efter infektioner med grupp A streptokocker som kan påverka bl a leder och hjärta (reumatisk feber) eller njurar (glomerulonefrit).



Grupp A streptokocker kan inte infektera djur eller leva fritt i naturen, de är helt anpassade efter ett liv i den mänskliga kroppen. Ett uttryck för detta är att många av de ämnen streptokocken producerar är ämnade att påverka eller binda till mänskliga proteiner. Det mest kända exemplet på detta är streptokockproteinet streptokinas som binder till ett mänskligt protein, plasminogen, och aktiverar detta till plasmin. Plasmin har förmågan att bryta ned fibrin som är den viktigaste beståndsdelen i blodkoagel. Plasminogen/plasmin ingår alltså i det mänskliga s k fibrinolytiska systemet som balanserar blodets koagulation. Streptokinas kan därför användas i behandlingen av sjukdomar med blodproppsbildning i kärlsystemet som t ex hjärtinfarkt.



Den del av plasmin som aktivt deltar i sönderdelandet av fibrin, serinproteasdomänen, har förmågan att sönderdela många typer av proteiner. I kärlsystemet är det dock viktigt att plasminaktiviteten regleras så att inte andra blodproteiner sönderdelas och så att blodkoagulationen motverkas i lagom utsträckning. Plaminogen/plasmins fem kringeldomäner är viktiga för dessa reglerande funktioner. I kringeldomänerna finns bindningsytor som binder till proteiner som har aminosyran lysin i sin ena ände. Dessa bindningsytor kallas därför för lysine binding sites (LBS). När plasminogen via LBS binder till fibrin underlättas dess aktivering till plasmin samtidigt som plasminhämmande ämnen får svårare att påverka plasminet. På detta sätt fokuseras plasminaktiviteten till fibrinet.



Grupp A streptokocker har förmågan att starkt binda många olika mänskliga proteiner som finns i blod t ex fibrinogen (förstadiet till fibrin) och immunförsvarets antikroppar. Streptokockernas förmåga att binda många av de mänskliga proteinerna har visats bero på ett ytprotein som kallas M proteinet. M-proteinerna är långa trådlika proteiner som täcker ytan hos streptokocker och som är betydelsefulla för déras förmåga att framkalla sjukdom. M proteinerna förekommer i många olika varianter och förmågan att binda mänskliga proteiner varierar också mellan olika streptokockstammar. Vi har undersökt streptokockers förmåga att binda mänskligt plasminogen och plasmin.



Delarbete I-IV



Förmågan att binda plasminogen undersöktes hos olika stammar av grupp A streptokocker, men även hos andra streptokocker (grupp C och G). Endast en mindre andel av de undersökta stammarna, företrädesvis de som brukar förorsaka hudinfektioner, kunde binda plasminogen. Denna bindning berodde på streptokockernas M protein. De plasminogenbindande M-proteinerna kunde undersökas i detalj genom att gensegmentet motsvarande M-proteinet överfördes till en annan bakterie (kloning) som producerade streptokockproteinerna i stor mängd. Dessa renades fram ur bakteriekulturerna bland annat med hjälp av just deras förmåga att binda plasminogen (affinitetsrening).



De undersökta M-proteinerna saknade lysiner i sina ändar som skulle kunna binda till LBS i plasminogens kringeldomäner. Genom att undersöka förändrade och förkortade varianter av M-proteinerna kunde den plasminogenbindande delen i stället lokaliseras till ett område omfattande 26 aminosyror i molekylens yttre tredjedel. Genom att undersöka bindningen till olika plasminogenfragment kunde den motsvarande bindningsytan i plasminogenmolekylen lokaliseras till den andra kringeldomänen. Ingen specifik funktion för denna domän har tidigare beskrivits.



Det plasminogen som fanns bundet till streptokockytan var möjligt att aktivera tilla aktivt plasmin med tillfört streptokinas. Detta ytbundna plasmin kunde sönderdela fibrin. Streptokocker med plasminogenbindande förmåga som växte i närvaro av plasma och därmed plasminogen hade inom en timme aktivt plasmin bundet till sin yta. Detta skedde trots att plasma även innehåller plasminhämmande substanser. De faktorer som var nödvändiga för denna förmåga var den plasminogenbindande sekvensen av M-proteinet och möjligheten att producera streptokinas. Genom dessa försök har vi visat att den plasminogenbindande egenskapen kan ha betydelse under förhållanden som liknar de som streptokocken möter i den mänskliga kroppen. Ytbundet plasmin skulle kunna fungera som en vävnadsnedbrytande faktor och därmed underlätta bakteriens spridning i vävnaden.



Dessa fynd har betydelse för förståelsen av hur streptokocker kan förorsaka infektion. De kan också ha betydelse för förståelsen av hur det fibrinolytiska systemet på molekylär nivå genom att för första gången identifiera en intern LBS-bindande yta och en unik funktion för en plasminogenkringla.

• author: Carlsson Wistedt, Annika
• supervisor: [unknown] [unknown]
• opponent: Dr Bessen, Debra E, Yale University School of Medicine
• organization: Division of Microbiology, Immunology and Glycobiology - MIG
• publishing date: 1999
• type: Thesis
• publication status: published
• subject: Microbiology in the medical area; Immunology in the medical area
• keywords: bacteriology, Microbiology, M protein, streptokinase, kringles, plasmin, Streptococcus pyogenes, plasminogen, virology, mycology, Mikrobiologi, bakteriologi, virologi, mykologi
• pages: 97 pages
• defense location: Rune Grubb salen, BMC, Sölvegatan 19, Lund
• defense date: 1999-09-17 10:15:00
• external identifiers: other:ISRN: LUMEDW/MEMG-1002-SE
• ISBN: 91-628-3672-2
• language: English
• LU publication?: yes
• id: 6fc9a2ab-0a79-4e55-b26f-2a10982a3a50 (old id 39812)
• date added to LUP: 2016-04-04 10:50:53
• date last changed: 2018-11-21 21:01:07