Cyclic Nucleotide Phosphodiesterase 3B: Regulation in rat adipocytes and 3T3-L1 cells

Abstract

Insulin stimulation of rat adipocytes results in phosphorylation and activation of the cyclic nucleotide phosphodiesterase 3B (PDE3B), a key enzyme in the antilipolytic signalling pathway of this hormone. In this thesis, the site phosphorylated in PDE3B upon stimulation of rat adipocytes with insulin and/or the beta-adrenergic agonist, isoproterenol is identified. In addition, upstream components in the insulin-induced signalling pathway, leading to phosphorylation and activation of PDE3B, are reported. Also, long-term regulation of the expression of PDE3B in response to tumour necrosis factor-alpha (TNF-a) and cyclic adenosine monophosphate (cAMP) were investigated in 3T3-L1 adipocytes.



Stimulation of rat adipocytes with insulin and/or isoproterenol results in phosphorylation of PDE3B at a unique site, serine302, which is also associated with activation of the enzyme. One important upstream component in the insulin-mediated signalling pathway, resulting in phosphorylation and activation of PDE3B, include phosphatidylinositol-3 kinase (PI3K), although this kinase is not directly responsible for the insulin-stimulated phosphorylation and activation of PDE3B. Insulin-stimulated PI3K-dependent kinases include the serine/threonine protein kinase B (PKB), mitogen-activated protein kinase (MAPK) and p70 ribosomal S6 kinase (p70S6K). While MAPK and p70S6K are not involved in the insulin-induced antilipolytic signalling pathway, leading to phosphorylation and activation of PDE3B, data are presented in this thesis, suggesting that PKB represents a potential PDE3B kinase.



Expression of PDE3B can be detected 4 days after initiation of differentiation of 3T3-L1 cells. Treatment of mature 3T3-L1 adipocytes with TNF-a results in downregulation of the expression of PDE3B , which correlates with both activation of protein kinase A (PKA), presumably reflecting an increase in intracellular cAMP concentrations, and with stimulation of lipolysis. Chronically treatment of 3T3-L1 adipocytes with cAMP also produces a reduction in the expression of PDE3B, an effect mediated via PKA. These results suggest that PDE3B is a novel target for long-term regulation by TNF-a and cAMP, which could contribute to the understanding of the underlying mechanisms for insulin resistance.

Abstract (Swedish)

Popular Abstract in Swedish

Denna avhandling är en s.k. sammanläggningsavhandling och innehåller fyra delarbeten (I-IV). Dessa delarbeten är publicerade i vetenskapliga tidskrifter, utom arbete IV som är föremål för slutlig granskning inför publikation. Syftet med mina studier har varit att undersöka hur metabolismen i kroppens fettceller (adipocyter) regleras, med fokus på ett insulinkänsligt enzym, fosfodiesteras 3B (PDE3B). Den akuta omsättningen av fett i adipocyterna styrs till en stor del av det hormonella samspelet mellan katekolaminer (såsom adrenalin) och insulin. Medan en ökad frisättning av katekolaminer i samband med svält, stress eller trauma leder till frisättning av fettsyror (lipolys) från adipocyterna, balanseras detta av en ökad insulinproduktion efter en måltid, som då leder till blockering av lipolysen (antilipolys) och istället överväger då lagring av fettsyror inför kommande behov. Katekolaminer och insulin har även andra metabola effekter på omsättningen av kolhydrater och protein i fett och i andra vävnader, såsom lever och muskel. Dessa effekter kan sammanfattningsvis sägas vara nedbrytande (katabola) för katekolaminer och uppbyggande (anabola) för insulin. Katekolaminer och insulin utövar sina effekter i adipocyten genom att initiera en kaskad av kedjereaktioner där en rad olika signalöverföringsmolekyler deltar. Ett flertal av dessa molekyler är s.k. protein kinaser, enzymer som katalyserar en överföring av ett fosfat till andra proteiner (substrat), vilket innebär en förmåga för kinaserna att reglera aktiviteten av sina respektive substrat. Beroende på vilken aminosyrarest som fosforyleras på substratet, klassificeras proteinkinaserna traditionellt som serin/treonin- eller tyrosinkinaser. Upptäckten av den centrala signalkedjekomponenten cykliskt adenosin monofosfat (cAMP) år 1959 möjliggjorde tidigt karakteriseringen av den bakomliggande molekylära mekanismen för den katekolaminmedierade lipolysen. Sålunda inleds lipolysen av ett ökat katekolaminpådrag, som resulterar i en ökad produktion av cAMP, vilket aktiverar ett protein kinas A (PKA), som i sin tur förmedlar signalen vidare till ett hormonkänsligt lipas (HKL), vilket i sin aktiva form spjälkar lagrade fettsyror. Till skillnad från lipolysen är inte den antilipolytiska signalkaskaden lika väl utredd. Det är sedan tidigare känt att insulin, via en kedjereaktion av fosforyleringar, aktiverar PDE3B som bryter ner cAMP och därmed bryter den lipolytiska kaskaden (se Fig. 6, sid. 31). Man vet också att ett insulinaktiverat serinkinas ansvarar för fosforyleringen och aktiveringen av PDE3B, även om identiteten av detta PDE3B-kinas ännu inte är fullständigt utredd. Vid en första anblick kan det tyckas kontroversiellt att PDE3B även fosforyleras och aktiveras som svar på adrenalinstimulering av adipocyter. Detta fenomen har emellertid sin förklaring i en önskvärd bibehållen balans mellan produktion och nedbrytning av cAMP och på så sätt erhålls en reglerad lipolys/antilipolys. Dock vet man ännu inte på vilken nivå dessa två signalkedjor sammanfaller (konvergerar), men en gemensam nämnare för båda signalvägarna är PDE3B. Ytterst lite är känt beträffande regleringen av PDE3B vid kroniskt förändrade tillstånd, d.v.s. under lång tid. Dock har aktiviteten av PDE3B visats vara förändrad vid sjukliga tillstånd såsom diabetes mellitus typ II, åldersdiabetes. Orsaken till åldersdiabetes är hittills ofullständigt utredd, men man tror att bakomliggande faktorer är en kombination av nedärvda anlag och förvärvade egenskaper, såsom övervikt, beroende på en alltför kaloririk kosthållning i kombination med otillräcklig fysisk aktivitet. En mindre än normal PDE3B-aktivitet har kunnat påvisas i adipocyter från patienter med diabetes, vilket innebär att en förändrad PDE3B aktivitet kan vara en faktor som bidrar till det diabetiska tillståndet. Tillämpliga metoder för studier av reglering av enzymer under kort (akut) och lång tid skiljer sig åt. Sålunda kan akuta effekter av hormoner på enzymaktiviteter, vilka exempelvis kan bero på fosforyleringar, undersökas med hjälp av s.k. enzymassays. I dessa kan enzymaktiviteten bestämmas antingen i hela (intakta) celler där enzymerna reagerar med varandra under de i cellen rådande betingelserna, eller i cellpreparationer där de olika enzymerna först extraheras från cellerna och sedan tillåts reagera i provröret i s.k. cellfria assays. Långsiktiga regleringar kan också påverka enzymaktiviteten, men har framför allt effekt på cellens produktion av dess proteiner och nukleinsyror, d.v.s de byggstenar som kodar för proteinerna i celler. Därför inbegriper undersökningar av dessa slag även metoder där man undersöker uttrycket, d.v.s. mängden av enzymet på ribonukleinsyra- (RNA) eller proteinnivå i cellen. De tre första delarbetena i avhandlingen behandlar den akuta regleringen av PDE3B i adipocyter som svar på insulinstimulering. Vid karakteriseringen av PDE3B i adipocyter hade man i vår forskargrupp tidigare visat att insulinstimulering av adipocyter resulterade i en aktivering av PDE3B, vilket i sin tur berodde på att enzymet var fosforylerat på ett serin, även om detta serin inte var identifierat. Vidare visste man sedan tidigare att PDE3B serinfosforylerades och aktiverades som svar på stimulering av fettceller med isoprenalin, en syntetisk katekolamin, samt att en samtidig stimulering med både insulin och isoprenalin närvarande ledde till en aktivering av PDE3B som var synergistisk, d.v.s. mer än additiv för de enskilda hormonerna. Detta hade tolkats som att PDE3B fosforylerades på två olika serin i närvaro av både insulin och adrenalin.



I delarbete I var det främsta syftet att identifiera vilket (eller vilka) serin(er) i PDE3B sekvensen som fosforylerades vid insulin- och/eller isoprenalinstimulering av adipocyter. Vi fann efter isoprenalinstimulering av adipocyter från råtta att endast ett serin fosforylerades i PDE3B sekvensen, nämligen serin 302 (S302). Att isoprenalinstimulering ledde till fosforylering av S302 var logiskt, eftersom detta serin ingår i en aminosyrasekvens som är känd för att fungera som igenkänningssignal för PKA, som ju stimuleras av katekolaminer. I detta arbete visade vi också att fosforyleringen av PDE3B vid stimulering av adipocyter med insulin ägde rum på ett och samma serin, S302, som vid isoprenalinstimulering. Detta var ett överraskande resultat eftersom det insulinstimulerade PDE3B-kinaset troddes fosforylera PDE3B på ett annat serin än det som fosforyleras vid katekolaminstimulering. Vidare visade det sig att en samtidig stimulering av adipocyter med både isoprenalin och insulin närvarande också resulterade i fosforylering av endast S302, ett resultat som också var i motsats till den tidigare hypotesen om två förekommande fosforyleringssäten på PDE3B. Med stöd av dessa fynd utkristalliserade sig en ny hypotes beträffande den akuta hormonella regleringen av PDE3B-aktiviteten och konvergensen för den lipolytiska och den antilipolytiska signalkaskaden. Enligt denna är det tänkbart att både isoprenalin och insulin har förmågan att aktivera ett PDE3B-kinas, som i sin tur fosforylerar och aktiverar PDE3B på S302 (Fig. 6, sid. 31).



Syftet med delarbete II var att studera rollen av ett känt insulinstimulerbart kinas, fosfatidylinositol-3 kinas (PI3K) i den antilipolytiska kaskaden i adipocyter. Detta arbete initierades av en rad publikationer, vilka visade att PI3K var involverat i flera insulinmedierade metabola effekter, inkluderande den insulinstimulerade antilipolysen. Genom att använda en PI3K-hämmare, wortmannin, i intakta adipocyter från råtta, kunde vi blockera dels den insulinmedierade antilipolysen, dels den insulinstimulerade fosforyleringen och aktiveringen av PDE3B samt aktiveringen av PDE3B-kinaset. Detta visade klart att PI3K var involverat i den av insulin inducerade antilipolytiska signalkedjan, på en nivå som föregår aktiveringen av PDE3B. I detta delarbete kunde vi även visa att PI3K inte direkt hade förmåga att fosforylera PDE3B (d.v.s att PI3K och det föreslagna PDE3B-kinaset inte var ett och samma kinas), eftersom wortmannin inte hade förmåga att hämma fosforyleringen av PDE3B i en cellfri assay. Däremot kunde vi visa att PDE3B-kinaset var beroende av ett aktivt PI3K, vilket var en viktig egenskap för PDE3B-kinaset i utredningen av dess identitet (se nedan).



Målet med delarbete III var att fortsätta arbetet med att identifiera vilka kinaser som kunde vara involverade i den insulinmedierade fosforyleringen och aktiveringen av PDE3B. Baserat på en preliminär karakterisering av det okända PDE3B-kinaset, kunde tre kända insulinstimulerade PI3K-beroende kinaser, inkluderande mitogenaktiverat protein kinas (MAPK), p70 S6 kinas (p70S6K) och protein kinas B (PKB) passa in som tänkbara kandidater. Genom att jämföra egenskaperna för de olika kinaserna under väletablerade proteinkemiska reningar av cellextrakt (kromatografier) kunde vi utesluta både MAPK och p70S6K som tänkbara PDE3B-kinaser. MAPK och p70S6K kunde även uteslutas genom att använda hämmare för dessa kinaser under försökens gång, vilket inte påverkade fosforyleringen och akiveringen av PDE3B. Däremot uppvisade PKB och det postulerade PDE3B kinaset samma kromatografiska egenskaper, vilket föranledde oss att vidare undersöka om PKB kunde vara PDE3B-kinaset. I detta syfte utnyttjade vi en nyupptäckt egenskap beträffande regleringen av PKB. I vår forskningsgrupp hade det nämligen tidigare visats att aktivering av PKB innebar en förflyttning (translokering) av kinaset från cellens inre till det omgivande cellmembranet vid stimulering av fettceller med peroxovanadat (en substans med insulinlika effekter). I det tredje delarbetet visade vi att denna aktiveringsmekanism passade in även på PDE3B-kinaset, vilket indirekt innebar en roll för PKB som ett PDE3B-kinas. Dessa fynd samt andra opublicerade resultat från vår forskargrupp har resulterat i den rådande hypotesen i vår forskningsgrupp att PDE3B-kinaset och PKB är ett och samma enzym. Det bör dock tilläggas att denna utredning är ofullständig och det återstår att direkt visa att dessa båda kinaser är identiska i intakta celler.



Det sista delarbetet är av annan karaktär än de tre första. I denna studie har vi undersökt om, och i så fall hur, uttrycket av PDE3B förändras vid långvarig behandling av adipocyter med substanser kända för att vara inblandade i sjukliga tillstånd, kopplade till övervikt. I detta syfte valde vi att arbeta med 3T3-L1 celler, en cellinje som kan beskrivas som odlade adipocyter. Anledningen till detta var dels att de primära fettceller som använts i de tidigare delarbetena är svårare att hålla vid liv under längre tidsperioder, dels att det tidigare var känt att dessa 3T3-L1 celler innehåller mätbara mängder av PDE3B protein.



Således har vi i delarbete IV undersökt effekterna av långvarig behandling av 3T3-L1 celler med tumour necrosis factor-a (TNF-a) och cAMP, två substanser som tidigare visats öka lipolysen i adipocyter. Båda dessa substanser har dessutom kunnat kopplas till insulinresistens, ett sjukligt tillsånd som är ett välkänt förstadium till åldersdiabetes. Vi demonstrerar i detta arbete att uttrycket av PDE3B, både på protein- och RNA-nivå, är reducerat (nedreglerat) vid långvarig behandling av 3T3-L1 celler med TNF-a eller cAMP. En nedreglering av PDE3B uttrycket i adipocyter under en längre tid, skulle troligen leda till en ökad mängd cAMP och därmed en ökad lipolys och förhöjda nivåer av fria fettsyror i blodet. Kroniskt förhöjda halter av fria fettsyror i blodet har sedan en tid varit känt som en av de bakomliggande orsakerna till insulinresistens. Med stöd av framkomna data i detta sista delarbete föreslår vi därför en tänkbar fysiologisk förklaring till varför ökade halter av TNF-a och cAMP bidrar till insulinresistens, även om den fullständiga molekylära mekanismen för det minskade uttrycket av PDE3B fortfarande är oklar och därför är föremål för fortsatta utredningar i vår forskningsgrupp.

• author: Landström, Tova
• supervisor: [unknown] [unknown]
• opponent: Ph D. Hallberg, Bengt, CMB, Umeå University, UMEÅ, Sweden
• organization: Department of Experimental Medical Science
• publishing date: 1999
• type: Thesis
• publication status: published
• subject: Basic Medicine
• keywords: 3T3-L1 TNF-alpha, adipocyte, insulin, p70S6 kinase, mitogen-activated protein kinase, protein kinase B, phosphatidylinositol-3 kinase, phosphodiesterase 3B, cAMP, lipolysis, phosphorylation, signal transduction, Biochemistry, Metabolism, Biokemi, metabolism
• pages: 145 pages
• defense location: Hörsal B, Kemicentrum, LUND
• defense date: 1999-11-19 10:15:00
• external identifiers: other:ISRN: LUMEDW/MECM--99/1033--SE
• ISBN: 91-628-3758-3
• language: English
• LU publication?: yes
• id: 2c4d3550-dcd1-4ca4-91fb-dc0e24a176c4 (old id 39958)
• date added to LUP: 2016-04-04 11:14:53
• date last changed: 2018-11-21 21:03:36