Xylan degradation by the thermophilic bacterium Rhodothermus marinus. Characterization and function of a thermostable xylanase

Abstract

A gene encoding a multidomain xylanase from the thermophilic bacterium Rhodothermus marinus has been cloned, sequenced and produced in Escherichia coli . The gene product was found to be a 109 kDa protein consisting of five domains. The catalytic domain and the two polysaccharide binding domains (PBD, previously called carbohydrate binding domains) have been cloned and produced separately for functional studies.



The catalytic domain is classified under glycosyl hydrolase family 10, a family in which 3D-structure determined representatives exhibit 8-fold alpha/beta(TIM)-barrels. It catalyses endo-hydrolysis of xylans and to a lower extent mixed linkage (1-3,4) ß-glucans. Hydrolysis has been observed using oligosaccharides with a degree of polymerisation of 4 or higher.



The two polysaccharide binding domains are likely displaying folds based on ß-strands. Their binding specificities to soluble substrates are corresponding well to observed substrate specificity of the catalytic domain. Among insoluble substrates they display binding to both amorphous cellulose and xylan. Both the binding level and thermal stability were markedly increased by additions of calcium ions. The three functionally characterized domains have transition temperatures for unfolding above, or long half-lives within, the growth temperatures (55-77 °C) of the organism R. marinus.



The efficiency in enzyme aided bleaching of kraft pulps was tested for three catalytically active forms of the enzyme. All forms lead to brightness gains although at different extents. The gain was found to be dependent on both enzyme construction and pulp characteristics. The trial with an enzyme construct lacking the two N-terminal PBDs was most successful.



A strategy for production in E. coli was also developed for two enzyme forms. The results show that production in the selected host-vector system was dependent on both cultivation mode, medium composition and type of inducer. Most efficient production was obtained in fed-batch cultivations in the presence of complex nutrients. Under these conditions the two alternative inducers, IPTG/lactose, resulted in approximately equal amounts of the produced recombinant proteins.

Abstract (Swedish)

Popular Abstract in Swedish

Min avhandling består av sex delarbeten som redovisar olika undersökningar av ett värmestabilt enzym (xylanas). Detta enzym är isolerat från en bakterie (Rhodothermus marinus) som lever i varma källor (vid 55-77 °C) och enzymet förväntas alltså fungera vid dessa temperaturer. Enzymets uppgift i bakterien är att förse den med lagom långa kolhydratmolekyler som bakterien kan använda som näring. Vi människor kan utnyttja dessa enzymer för helt andra syften. I mitt arbete har det använts som ett miljövänligt steg i pappersmassablekning. För att kunna utnyttja det så effektivt som möjligt behöver vi först lära känna enzymet. Vad består det av och hur fungerar det?



Enzymer katalyserar reaktioner, och kan liknas vid verktyg som för samman ämnen så att de kan reagera med varandra. När uppgiften är klar går enzymet oförändrat ur reaktionen. Enzymer är protein, och de är sammansatta av aminosyror. Dessa aminosyror är byggstenarna som bygger upp enzymets arkitektur. Med hjälp av gentekniska metoder kan man ta reda på vilka aminosyror som ingår i det enzym som studeras. I ett delarbete har DNA-sekvensen (arvsmassan) som kodar för proteinet i bakterien bestämts. Med hjälp av vetskapen att den genetiska koden är universell har koden kunnat översättas till aminosyra-byggstenarna. Den sekvens-bestämda delen av bakteriens DNA har överförts till en mera välkänd bakterieart (Escherichia coli), och där har kända signaler utnyttjats som möjliggör att man kan starta produktion av det önskade enzymet på ett kontrollerat sätt.



Det enzym som jag har studerat har till uppgift att katalysera nedbrytning av polysackarider (långa kolhydratkedjor). Enzymet heter xylanas och katalyserar nedbrytning av polysackariden xylan till kortare bitar, sk. oligosackarider. Enzymet har visats bestå både av enheter som binder till polysackarider och en enhet som katalyserar nedbrytning av polysackariden. Enheterna som binder till polysackariden kan ha till uppgift att öka effektiviteten i nedbrytningen. I tre av delarbetena har de bindande och den katalyserande enheten analyserats för att ta reda på vilka bindningar som bryts ned, men också hur stabila de olika enheterna är mot värme. Alla enskilda enheter visades fungera vid den temperatur som är den högsta bakterien kan växa i (77 °C). Både de bindande och den katalytiska enheten utnyttjade samma typer av polysackarider. Detta stöder teorin att de bindande enheterna har till uppgift att öka effektiviteten i nedbrytningen genom att den katalytiska delen p.g.a. bindningen hålls i närheten av de polysackarider som den har till uppgift att främja nedbrytning av.



Xylan finns normalt i cellväggarna i växter och träd. Xylan kallas för hemicellulosa, och har liksom cellulosa till uppgift att ge stöd och struktur åt växtcellerna. I växtcellerna finns också ett ämne som heter lignin. Ligninet är delvis bundet till xylan. Det är ligninet som gör att papper blir brunt om det inte bleks. Om xylanaser används i blekning innebär det att förkortade kolhydratkedjor med lignin kan sköljas bort ur processen. Man kan inte helt ersätta traditionella blekningskemikalier genom att använda xylanaser, men man kan minska förbrukningen (vilket är önskvärt av miljöskäl) och man kan också i många fall få ett vitare papper om man låter xylanaser verka som ett steg i blekprocessen. Detta har studerats i ett delarbete.



Värmestabila enzymer är en fördel i blekningsprocesser. Normalt sker dessa processer vid höga temperaturer. För att enzymer ska vara ett lönsamt alternativ är det viktigt att de dels ska fungera utan att man ändrar processförhållandena, dels ska de kunna produceras i stora mängder utan dyra omkostnader. Därför har också ett delarbete av min avhandling behandlat hur man ska kunna producera enzymet. Vi har kunnat visa att om man kontrollerar odlingsförhållandena av Escherichia coli så kan stora mängder av enzymet produceras, vilket i sin tur möjliggjorde försöken med massablekning.



Arbetet som redovisas i avhandlingen redogör alltså för det studerade enzymets uppbyggnad och funktion. Enzymet har också producerats och provats i enzymatisk blekning av pappersmassa, för att visa på och utvärdera dess möjligheter i en process där användning av enzymer är av miljömässigt värde.

• author: Nordberg Karlsson, Eva
• supervisor: [unknown] [unknown]
• opponent: Prof Danson, Michael J, University of Bath, UK
• organization: Biotechnology
• publishing date: 1999
• type: Thesis
• publication status: published
• subject: Industrial Biotechnology
• keywords: fed-batch cultivation, kraft pulp, bleaching, glycosyl hydrolase family 10, recombinant xylanase, polysaccharide binding domain, Biotechnology, Bioteknik
• pages: 180 pages
• defense location: Lund University, lecture hall C, Center for Chemistry and Chemical Engineering, Lund, Sweden
• defense date: 1999-05-21 13:15:00
• external identifiers: other:ISRN: LUTKDH/TKBT--99/1040--SE
• ISBN: 91-628-3598-X
• language: English
• LU publication?: yes
• id: 3ad5904d-5028-4179-a5ab-97f91c2b5acd (old id 39634)
• date added to LUP: 2016-04-04 11:20:26
• date last changed: 2019-06-20 02:20:23