INOSITOL PHOSPHOLIPID-BASED SIGNAL TRANSDUCTION IN PLANTS Phosphoinositide-Specific Phospholipase C and 3-Phosphoinositide Dependent Protein Kinase-1 in Arabidopsis thaliana

Abstract

Phosphoinositides (PIs) play major roles in cell signal transduction. Although it is clear that PIs are important components also in plant signalling, little is known about their roles in plant cells, compared to animal cells. This thesis describes work on two PI-dependent enzymes involved in plant intracellular signalling, phosphoinositide-specific phospholipase C (PI-PLC) and 3-phosphoinositide dependent protein kinase-1 (PDK1) in the model plant Arabidopsis.



Plant genomes encode numerous PI-PLC isoforms. However, while animal PI-PLCs fall into five distinct subfamilies, all known plant isoforms form one single family. Based on sequence comparison, plant PI-PLCs are closely related to the animal PI-PLCdelta subfamily, but with a domain structure more similar to the PI-PLCzeta subfamily. Plant PI-PLCs contain three well conserved domains, X, Y and C2, and a less conserved N-terminal region. Using sequence-specific antibodies, we have localised a plant PI-PLC, AtPLC2, to the plasma membrane. We have shown that the AtPLC2 N-terminal region, containing an EF-hand domain, is required for enzyme activity, but not for lipid binding. All cloned Arabidopsis PI-PLCs (AtPLC1-5) have an absolute calcium requirement for activity, but show differences in calcium activation profiles. For example, AtPLC2, AtPLC4 and AtPLC5 reach their maximal activity at 1 micromolar, while AtPLC1 and AtPLC3 clearly require higher concentrations of calcium for maximal activity. These differences may allow differential regulation of these enzymes. The complete set of Arabidopsis PI-PLC genes was investigated. All genes are expressed throughout the plant during normal growth conditions, whereas the expression of three genes, AtPLC1, AtPLC4 and AtPLC5 is increased by exposure to stresses, such as cold, drought, and salt.



To date, very little is known about PDK1 and its physiological role in plant cells. The plant PDK1 homologue studied, AtPDK1, contains a PH domain, in similarity with animal PDK1. We have shown that AtPDK1 is autophosphorylated, and three phosphorylation sites, Thr-176, Ser-276, and Ser-382, have been identified. Mutational analysis revealed that Thr-167 and Ser-276 are essential for enzyme autophosphorylation and downstream activity. Neither of these sites are conserved in animal PDK1, suggesting different mechanisms of PDK1 regulation between plants and animals. Mutational analysis also revealed that Asp-167 is critical for AtPDK1 autophosphorylation and enzyme activity. Furthermore, we identified a potential AtPDK1 substrate, AtS6k2, a homologue to the S6 kinases, known to be involved in mammalian cell growth and proliferation.

Abstract (Swedish)

Popular Abstract in Swedish

Alla levande organismer måste kunna anpassa sig till förändringar i sin omgivning, såsom kyla, värme eller torka. Vid sådana förändringar tar enskilda celler emot signaler ifrån sin omgivning via särskilda s.k. receptorproteiner på cellytan. Receptorproteinerna skickar signalerna vidare in i cellen, där de kan ge upphov till en kedja av processer, vilka slutligen leder till att cellen anpassar sig till den nya situationen. Denna process kallas signaltransduktion.



Eftersom växter, till skillnad från djur och människor, inte kan förflytta sig bort från ogynnsamma betingelser, ställs särskilda krav på anpassning för att de ska kunna överleva. Växters signaltransduktionsmekanismer är dock relativt lite studerade och kunskapen om vilka receptorproteiner och processer som ingår är väldigt liten.



Jag har studerat och karaktäriserat två proteiner som är involverade i signaltransduktion i backtrav (Arabidopsis thaliana), en växt ofta använd som modellorganism. Dessa två proteiner, fosfolipas C (PLC) och 3-fosfoinositid-beroende protein kinas-1 (PDK1), är båda beroende av en viss typ av fosfolipider, fosfoinositider, för sin aktivitet. Fosfoinositider ingår som en kvantitativt liten del av cellernas yttre membran, plasmamembranet, och har visat sig väldigt betydelsefulla för bl.a. signaleringsprocesser.



PLC är involverat i växters svar på stressituationer, såsom torka och kyla, och finns i nio olika varianter (isoformer) i backtrav, AtPLC1-9. Vi har visat att en av isoformerna, AtPLC2, sitter specifikt lokaliserad i plasmamembranet. Vidare har vi visat att den här isoformen, och troligen även övriga isoformer, behöver en särskild del av proteinet, den s.k. N-terminala delen, för att kunna vara aktivt. Genom att studera genuttrycket av de nio isoformerna har vi kunnat visa att dessa finns tillgängliga i hela växten, med undantag för AtPLC3 och AtPLC6, som inte finns i blommor respektive rötter. Jag har också studerat kalciumjoners påverkan på AtPLC1-5, där vissa isoformer, AtPLC1 och AtPLC3, visade sig behöva högre halt av kalcium än de övriga för att uppnå full aktivitet. Eftersom kalcium är en viktig intracellulär signal, vars halt kan ändras som svar på yttre signaler, skulle växtceller kunna utnyttja detta för att specifikt reglera de olika PLC-isoformerna.



En viktig regleringsmekanism inom signaltransduktionskedjor är fosforylering. En fosforylering innebär att en fosfatgrupp ifrån en energirik förening, oftast ATP, kopplas till en specifik aminosyra i ett protein. Jag har visat att fosforylering av PDK1 i backtrav, AtPDK1, är nödvändigt för att proteinet ska vara aktivt. Specifikt har vi lokaliserat fosforyleringen till tre aminosyror i AtPDK1s aminosyrasekvens; treonin-176, serin-276 och serin-382. Aktiviteten av AtPDK1 visade sig vara helt beroende av fosforylering av de första två av dessa. Vidare har jag visat att AtPDK1 i sig kan fosforylera ett S6 kinas, AtS6k2, ett protein som visat sig viktigt för cellers tillväxt och utveckling. Slutligen har jag studerat inverkan av en typ av regleringsproteiner, 14-3-3 proteiner, på AtPDK1 och sett att olika isoformer av dessa kan aktivera eller hämma AtPDK1.



Sammanfattningsvis har mina resultat medverkat till att förstå regleringen av två enskilda proteiner, PLC och PDK1, i växters signaltransduktionskedjor. Även om dessa proteiner endast utgör en liten del av en sådan kedja, så krävs kunskap om alla de enskilda stegen för att kunna förstå signaltransduktionsprocessen i sin helhet.

• author: Otterhag, Lotta
• supervisor: Marianne Sommarin
• opponent: Dr Dove, Stephen, Department of Biosciences, University of Birmingham
• publishing date: 2005
• type: Thesis
• publication status: published
• subject: Biological Sciences
• keywords: Lipids, steroids, membranes, Lipider, steroider, mebran, phospholipase C, enzymologi, Proteiner, enzymology, Proteins, Växtbiokemi, Plant biochemistry, phosphorylation, PDK1, calcium, EF-hand, plasma membrane, Arabidopsis thaliana
• pages: 102 pages
• defense location: Lecture hall B Center for Chemistry and Chemical engineering Getingevägen 60, Lund Sweden
• defense date: 2005-01-21 13:15:00
• ISBN: 91-7422-072-1
• language: English
• LU publication?: no
• id: 3e181837-7af6-4778-85d8-f6dac4b979f6 (old id 544177)
• date added to LUP: 2016-04-04 11:23:20
• date last changed: 2020-06-02 09:56:02