Protein folding variants, for better or for worse? The lesson learned from HAMLET.

Abstract

By varying its secondary or tertiary structure a single protein can attain new biological functions. The amyloid forming proteins are the best known examples where a change in conformation leads to the formation of amyloid fibrils that accumulate in tissues and cause disease.



a-lactalbumin in contrast, is an example of a protein that acquires a beneficial function when the conformation is altered. The normal function of the protein is to ac as a substrate specifier for the enzyme galactosyl transferase aiding in the production of lactose. If partially unfolded and stabilized by a specific fatty acid cofactor a-lactalbumin forms HAMLET (Human a-lactalbumin made lethal to tumour cells) that induces apoptosis in tumour cells while sparing healthy cells.



We isolated this novel form of a-lactalbumin from human casein and demonstrated that the protein is stable in a partially unfolded conformation even at physiological conditions (paper I). Native a-lactalbumin can be converted to the apoptosis inducing protein if partially unfolded and in the presence of a specific fatty acid cofactor (paper II). The interaction between the protein and the lipid is stereo-specific and we have demonstrated that the fatty acid cofactor have to be unsaturated and in the cis conformation (paper III). The partially unfolded conformation per se is unstable at the conditions used in the apoptosis assay, to investigate whether the protein alone is sufficient to induce apoptosis we used a-lactalbumin mutated in the calcium-binding site thus locked in a partially unfolded conformation. We demonstrate that partially unfolded a-lactalbumin is unable to induce apoptosis thus the conformation and the biological activity of HAMLET is defined both by the protein and by the lipid (paper IV). Finally based on differences in the a-lactalbumin sequence and structure between different species and their ability to form HAMLET like complexes we tentatively identify the fatty acid binding site as being the cluster of hydrophobic residues located in the interface between the a- and the b-domain (paper V).



We have thus identified two key elements that regulate the conformation and the function of a-lactalbumin i.e. the calcium ion and the fatty acid cofactor. We speculate that folding variants with new biological functions compared to the native protein may occur very frequently and these mechanisms exist for the benefit of the organism.

Abstract (Swedish)

Popular Abstract in Swedish

Vad är det för något i human mjölk som dödar cancer celler? Kan “fel” veckade proteiner vara nyttiga? Kan fett vara inblandat i protein veckning? Det är några av frågorna som tas upp i denna avhandling.



Allt levande består av proteiner som i sin tur är uppbyggda av amino syror. Det finns 20 st. olika amino syror som på olika sätt kan länkas samman till proteinkedjor. Dessa kedjor packas så att ett protein till slut får sin unika tredimensionella struktur. På senare tid har man börjat förstå att ett protein kan ändra sin funktion genom att ändra sin struktur på olika sätt. Mycket uppmärksammat är det s.k. prion proteinet som ger upphov till bl.a. galna kosjukan. Det friska prion proteinet kan göras om till det sjuka om man ändrar på den tredimensionella strukturen.



I vår grupp har vi studerat ett annat protein som har olika funktion beroende på den tredimensionella strukturen nämligen a-laktalbumin. a-laktalbumin är ett globulärt protein som består av två domäner. Det hålls ihop av fyra disulfid bindningar och mellan domänerna finns ett bindningsställe för kalcium. Man har i många år använt proteinet som modell när man studerat hur proteiner veckar sig eftersom det kan befinna sig i ett intermediärt tillstånd där det inte är helt denaturerat men heller inte helt nativt. Detta tillstånd kallas ”molten globule state” eller ”apo” beroende på hur man genererat det. a-laktalbumin finns i stora mängder i human mjölk. I bröstet hos den ammande kvinnan har proteinet en speciell struktur och det fungerar som del i ett enzymkomplex som bildar mjölksockret laktos. Om man veckar upp proteinet lite grand och sedan använder en speciell fettsyra för att stabilisera proteinet så får a-laktalbumin en helt ny funktion; det dödar cancer celler. I den första artikeln som ingår i denna avhandling renar vi fram det cancer cell dödande komplexet från human mjölk och identifierar det som a-laktalbumin låst i en delvis uppvecklad struktur (artikel I). Vi visar också att den s.k. nativa formen av proteinet inte kan döda cancer celler (artikel I). Utifrån denna kunskap spekulerade vi att det borde vara möjligt att ”tillverka” komplexet med utgångspunkt från rent protein. I artikel två visar vi att man kan konvertera nativt a-laktalbumin till det cancer cell dödande komplexet. För att detta ska ske måste man först öppna upp proteinstrukturen så att man får apo formen. Detta görs genom att ta bort kalciumjonen. Sedan krävs en kofaktor för att det aktiva komplexet ska erhållas. Vi visar att en specifik fettsyra nämligen oleinsyra kan fungera som kofaktor och kallar det framställda komplexet för HAMLET (human a-lactalbumin made lethal to tumour cells) (artikel II). Vi blev genast nyfikna på hur interaktionen mellan proteinet och fettsyran fungerade, var det bara oleinsyra som kunde fungera som kofaktor och behövdes verkligen både proteinet och fettsyran för aktiviteten? I artikel tre undersöker vi en rad olika fettsyror för att se om de kan fungera som kofaktor. Vi valde fettsyror med olika lång kolkedja, med eller utan dubbelbindningar (dvs. omättade eller mättade) och fettsyror där dubbelbindningen sitter i cis (på samma sida) eller i trans (på motsatt sida) konformation. Vi kunde visa att interaktionen mellan proteinet och fettsyran är stereospecifik och för att komplexet ska bildas krävs en omättad fettsyra med dubbelbindningen i cis konformation, bäst fungerar fettsyror med en 18 kol lång kedja och dubbelbindning mellan kol 9-10 eller 11-12 (artikel III). För att svara på frågan om det räcker med bara proteinet var vi tvungna att använda muterat protein. Detta beror på att vildtyps a-laktalbumin binder kalcium väldigt starkt vilket innebär att det inte går att behålla i apo formen i vårat cellsystem eftersom det i cellmediet finns mycket kalcium. Om man däremot använder a-laktalbumin som är muterat så att det inte kan binda kalcium så har man ett protein som är i apo formen även i våra cellexperiment. I artikel IV visar vi att det inte räcker med bara det lite uppvecklade proteinet (artikel IV). För att döda cancerceller krävs hela komplexet och fettsyran behövs kanske för att ge proteinet den exakt rätta konformationen eller så behövs den någonstans i signaleringsvägen. Till vilken del av a-laktalbumin binder fettsyran? För att försöka svara på den frågan har vi studerat a-laktalbumin strukturen, jämfört sekvens och struktur mellan olika arter och analyserat hur andra proteiner binder fettsyror. I arbete V spekulerar vi att bindningsstället för fettsyran är i ett område mellan de två domänerna. Man har visat att den ena domänen (b-domänen) är mycket mindre strukturerad än den andra när a-laktalbumin är i apo formen. Detta innebär att en ansamling av hydrofoba aminosyror då blir exponerade. Vad gäller andra fettsyrabindande proteiner har man visat att inbindningsstället alltid är omgärdat av några stycken positivt laddade (basiska) aminosyror som ser till att fettsyrans huvudgrupp får rätt orientering. I humant a-laktalbumin sitter det tre stycken basiska aminosyror runt de hydrofoba aminosyrorna mellan domänerna. Vi visar att om man använder a-laktalbumin från häst och gris där en av de basiska aminosyrorna är utbytta mot en negativt laddad aminosyra och där gris a-laktalbumin dessutom saknar en amino syra vid position 68 så är det mycket svårt att konvertera proteinet till HAMLET liknande komplex (artikel V).



Slutligen kan man ju spekulera i om HAMLET har någon relevans in vivo? Det finns studier som visar att ammade barn har en lägre frekvens av vissa cancertyper vilket tyder på att det borde finnas molekyler i bröstmjölk som kan eliminera cancerceller. Om HAMLET finns i mjölken eller bildas i det ammade barnets mage vet vi inte, men från litteraturen vet vi att miljön i barnets magsäck främjar den uppvecklade formen av a-laktalbumin. Dessutom spjälkas fettet av lipaser så att fettsyror frisätts, och som av en händelse är det vanligaste proteinet just a-laktalbumin och den vanligaste fettsyran just oleinsyra!



a-laktalbumin är ett nytt exempel på att ett protein kan erhålla nya biologiska egenskaper genom att ändra sin tredimensionella struktur och till skillnad från prion proteinet så har den nya varianten av a-laktalbumin goda egenskaper.

• author: Svensson, Malin
• supervisor: [unknown] [unknown]
• opponent: Professor Dobson, Christopher M, University of Cambridge
• organization: Division of Microbiology, Immunology and Glycobiology - MIG
• publishing date: 2002
• type: Thesis
• publication status: published
• subject: Microbiology in the medical area; Immunology in the medical area
• keywords: Clinical biology, prion, apo, fatty acid, apoptosis, lactalbumin, folding variant, Klinisk biologi
• pages: 208 pages
• defense location: Patologensföreläsningssal, Sölvegatan 23 Lund
• defense date: 2002-03-07 10:15:00
• external identifiers: other:ISRN: LUMEDW/MEMG--0013--SE
• ISBN: 91-628-5018-0
• language: English
• LU publication?: yes
• additional info: Article: 1.Svensson M, Sabharwal H, Håkansson A, Mossberg, A-K, Lipniunas P, Leffler H, Svanborg C and Linse S. Molecular characterization of a-lactalbumin folding variants that induce apoptosis in tumour cells. J Biol. Chem 1999; 274:6388-6396 Article: 2. Svensson M, Håkansson A, Mossberg A-K, Linse S and Svanborg C. Conversion of a-lactalbumin to a protein inducing apoptosis. Proc Natl Acad Sci USA 2000; 97:4221-4226. Article: 3. Svensson M, Mossberg A-K, Linse S and Svanborg C. Lipids as cofactors in protein folding. Stereo-specific protein-lipid interactions are required to form HAMLET (human a-lactalbumin made lethal to tumour cells). Submitted Article: 4. Svensson M, Düringer C, Hallgren O, Mossberg A-K, Linse S, Brooks C, Berliner L and Svanborg C. Apo-a-lactalbumin requires a lipid cofactor to trigger apoptosis. Submitted Article: 5. Petterson J, Svensson M, Mossberg A-K, Tuhlin E, Linse S and Svanborg C. Studies on the lipid binding site of HAMLET. Manuscript
• id: 4007189b-1a57-463e-b45c-bf5cd49eb38b (old id 464344)
• date added to LUP: 2016-04-04 12:23:56
• date last changed: 2018-11-21 21:10:43