Rate Limiting Factors For Protein Folding.

Abstract

Abstract. This thesis describes factors that are rate limiting for the folding of two small proteins, U1A and CI2 which fold without accumulating intermediates. The [GdnHCl] dependencies of the unfolding- and refolding kinetics of U1A display downward curvatures. However, as the curvatures are precisely matched and no indications of formation of partially structured intermediates are seen, the folding behaviour is still consistent with a two-state model. Instead, the curvatures seem related to Hammond behaviour, i.e. movements of the transition state on the reaction coordinate. This implies that the free energy barrier is broad and rather flat. Consequently the search for productive interactions in the folding protein does not take place at ground state level but at high energy. Analysis of mutants of CI2 shows, that to a larger extent than previously thought, these mutants also display transition state movements. Possibly, the activation barrier for folding is generally broad but with a more or less rugged surface. When the ruggedness involves localised features that are much higher than the surrounding barrier, the protein will appear to have a localised transition state. Mutations that lower these localised features will then set free movements of the transition state. One way to monitor diffusive events in protein folding is to measure the rate of folding as a function of solvent viscosity. Unfortunately the viscogens (osmolytes) added in these studies also tend to stabilise the protein and thus have dual effects on the folding rate. When CI2 is refolded in the presence of several different osmolytes we find no viscosity dependence on the refolding kinetics. However, we find that the osmolytes, in addition to their other effects also induce a collapse of the denatured protein. The collapse increases the reconfiguration time of the protein and thereby retards folding. At [protein]>1mM, U1A aggregates early in kinetic refolding experiments. This leads to a retardation of folding at low [denaturant], which resembles the accumulation of an intermediate. The retardation results from kinetic competition: at high [protein] the fraction of protein that aggregates increases and eventually dominates the refolding amplitude. As the rate of folding after aggregation is slower than direct folding, this results in an apparent decrease of the folding rate. Similar experiments with CI2 show that also this protein undergoes transient aggregation. Furthermore, as both U1A and CI2 fold without accumulating intermediates the protein aggregates likely form directly from the coil.

Abstract (Swedish)

Popular Abstract in Swedish

Proteiner är stora kedjelika molekyler som syntetiseras i cellen med utgångspunkt från arvsmassan, DNA. I alla organismer har proteinerna en mängd uppgifter som kan sträcka sig allt ifrån att vara byggnadsmaterial i senor och bindväv till att fungera som avancerade molekylära maskiner i organismens energiomsättning. I stor utsträckning reglerar olika proteiner också bildningen av andra proteiner genom att binda till cellens DNA. Nyckeln till proteinernas otroligt stora spektrum av olika funktioner ligger i deras tredimensionella struktur. För att ett protein ska fungera t ex som en kemisk katalysator, ett enzym, krävs att den substans enzymet ska bryta ner kan binda till proteinets yta. Ofta är den här typen av bindning väldigt specifik, ungefär som att en typ av nyckel bara passar till en viss typ av lås. Alltså, om låset är felkonstruerat kommer nyckeln inte att passa. Detta är precis vad som kan hända hos personer, djur eller växter som har fått skador eller mutationer i sin arvsmassa. Om skadorna är för stora kommer de proteiner som syntetiseras efter "ritningen" i arvsmassan inte längre att kunna bilda rätt tredimensionell struktur. Följdaktligen kommer de heller inte att fungera. Sedan lång tid tillbaka är det känt hur arvsmassan kodar för byggstenarna, aminosyrorna, för att tillverka proteiner. Idag är det också praktiskt möjligt att i laboratoriet syntetisera långa kedjor av aminosyror som sedan ska vecklas ihop till fungerande proteinstrukturer. Rent teoretiskt sett skulle man alltså kunna hjälpa personer med ärftliga sjukdomar genom att tillverka proteiner och ge som läkemedel. Detta istället för de felaktiga proteinerna som deras DNA kodar för. Praktiskt sett är det inte lika enkelt. Man vet nämligen inte hur aminosyrakedjorna vecklas ihop för att bilda fungerande proteiner.



Under de förhållanden som råder i cellen är inte den utvecklade aminosyrakedjan stabil. Den vecklar därför ihop sig så snart den syntetiserats färdigt. För att studera vecknings-processen måste man alltså finna ett sätt att veckla ut den, att denaturera den. Detta kan man t ex göra genom att höja temperaturen, vilket är just vad som händer när man kokar ägg. Ett annat alternativ är att sänka eller höja pH i lösningen med syra eller lut eller att tillföra kemiska denatureringsmedel t ex urea (urinämne). När man så denaturerat proteinet för att studera veckningen kommer nästa problem: I många fall är de delvis strukturerade stadier som proteinet går igenom på sin väg från kedja till färdig form inte heller stabila. Ibland kan det vara svårt att stabilisera dessa "halvstrukturer" på samma vis som man gjorde med den utvecklade kedjan. Man får därför använda sig av ett indirekt sätt att studera dem. Detta indirekta sätt innebär att man tittar på hastigheterna för hur kedjan vecklas ihop. Denna avhandling sammanfattar ett antal studier som syftar till att bättre förstå de hastighetsbegränsande stegen i veckningsprocessen.



I den första artikeln beskrivs veckningen av ett litet protein, U1A, och i den andra, veckningen av en lång rad mutanter av ett annat protein CI2. Studierna visar att veckningsprocessen sker genom omvandling mellan delvis strukturerade former som inte är stabila. De visar också att bildning av stabila "halvstrukturer" kanske inte är nödvändigt för snabb och effektiv veckning.



Artikel tre handlar om hur veckningsprocessen påverkas när man tillsätter ämnen som kallas osmolyter. Till osmolyterna räknas bland annat vanligt socker och kylarglykol. Sedan tidigare är det känt att dessa ämnen dels ökar stabiliteten hos proteiner och dels gör vattenlösningar mer trögflytande. Studien i den här avhandlingen visar att osmolyterna påverkar vecknings-processen också genom att de driver utvecklade proteiner att dra ihop sig till en mer kompakt form. Från det kompakta tillståndet tar det sedan längre tid att veckla ihop proteinet än normalt, eftersom det går långsammare att förflytta proteinkedjan.



Artiklarna fyra och fem handlar om hur hastigheten för veckning påverkas av aggregering, som är en sidoreaktion till veckningsprocessen. Aggregering är när många proteinmolekyler slår sig samman och bildar stora och ordnade eller oregelbundna klumpar. I många neurologiska sjukdomar, till exempel Alzheimers sjukdom och i Galna-Ko-Sjukan, utgör ohämmad proteinaggregering en del av sjukdoms-bilden. Resultaten visar att proteinaggregering kan ge upphov till beteende hos protein-veckningsdata som man tidigare bara sett i samband med bildning av halvstrukturerade former under veckningen. De tyder också på att proteinaggregat kan bildas av den utvecklade proteinkedjan och inte av delvis ihopvecklade former som man tidigare trott.

• author: Berggård Silow, Maria
• supervisor: [unknown] [unknown]
• opponent: Radford, Sheena E., University of Leeds, UK.
• organization: Biochemistry and Structural Biology
• publishing date: 2000
• type: Thesis
• publication status: published
• subject: Biological Sciences
• keywords: kinetic competition, transient aggregation, diffusion control, reconfiguration time, collapse, osmolytes, broad barriers, Hammond behaviour, two-state, U1A, CI2, Proteins, enzymology, Proteiner, enzymologi
• pages: 127 pages
• defense location: Sal B Chemical Centre.
• defense date: 2000-05-19 10:15:00
• external identifiers: other:ISRN: LUNKDL/(NBK-1061)2000
• ISBN: 91-628-4134-3
• language: English
• LU publication?: yes
• additional info: Article: I Silow, M. and Oliveberg, M. (1997). High Energy Channelling in Protein Folding. Biochemistry. June 24;36(25); 7633-7637 Article: II Oliveberg, M., Tan, Y-J., Silow, M. and Fersht, A.R. (1998). The Changing Nature of the Protein Folding Transition State: Implications for the Shape of the Free-energy Profile for Folding. J. Mol. Biol. Apr 10;277(4): 933-943. Article: III Silow, M. and Oliveberg, M. Osmolyte Induced Coil-Collapse in Protein Folding. Manuscript in preparation. Article: IV Silow, M. and Oliveberg, M. (1997). Transient Aggregates in Protein Folding are Easily Mistaken for Folding Intermediates. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. Jun 10; 94(12): 6084-6086 Article: V Silow, M, Tan, Y-J., Fersht, A.R., and Oliveberg, M. (1999). Formation of Short-Lived Protein Aggregates Directly from the Coil in Two-State Folding. Biochemistry. Oct. 5; 38(40): 13006-13012.
• id: 5cd5f65c-5b5b-4838-bb2e-101aa812a3ba (old id 40489)
• date added to LUP: 2016-04-04 11:13:28
• date last changed: 2018-11-21 21:03:27