L68Q cystatin C: Expression, cellular transport and turnover of the cystatin C variant forming amyloid in patients with Hereditary Cystatin C Amyloid Angiopaty (HCCAA)

Abstract

Hereditary cystatin C amyloid angiopathy (HCCAA) is a disorder characterised by multiple strokes in young adults, resulting in paralysis and dementia. The disease is caused by a mutation in the gene coding for the peptidase inhibitor cystatin C. The mutation causes an amino acid substitution Leu68 -> Gln in cystatin C (L68Q cystatin C) which results in deposition of the protein in the blood vessels in the brain. The overall goal of this study was to elucidate the pathogenic mechanisms leading to amyloid deposition in patients suffering from HCCAA. This was addressed by studying factors involved in the regulation of cystatin C expression and the behaviour of the L68Q variant in different cellular systems and clinical samples. When studying factors involved in cystatin C gene regulation we found that the steroid dexamethasone causes a significant and dose-dependent increase in cystatin C secretion from cultivated HeLa cells, up to a maximal increase of 80% at biological levels of the steroid. When looking at monocytes isolated from HCCAA patients and transfected mouse and human neuroblastoma cells we saw, in all cells tested, that the mutated cystatin C was secreted, but at a significantly lower rate than the wildtype protein. An increased accumulation of cystatin C was seen in all transfected cells expressing the gene encoding L68Q cystatin C. The accumulated L68Q cystatin C is insoluble and located mainly in the endoplasmic reticulum. When studying human neuroblastoma cell-lines we saw that they expressed and secreted very high levels of cystatin C compared to other human cell-lines tested. The neuroblastoma cells were also different from other cell types in that they showed intracellular insoluble wildtype cystatin C. Finally we investigated the turnover of cystatin C in plasma and cerebrospinal fluid (CSF) from HCCAA patients. Both L68Q and wildtype cystatin C were found in plasma from these patients but only the wildtype cystatin C could be detected in CSF.

Abstract (Swedish)

Popular Abstract in Swedish

Sjukdomen ärftlig hjärnblödning med cystatin C-amyloid angiopati (engelsk förkortning, HCCAA) beror på att en ärftlig mutation i genomet förändrar en byggsten (aminosyra) i proteinet cystatin C. Cystatin C-varianten som uppkommer deponeras som olösligt material (amyloid) i blodkärlens väggar och leder till att dessa ofta brister före 40-årsåldern med hjärnblödning som följd.



Cystatin C som hör till cystatinfamiljen av proteiner, består av 120 aminosyror och har som normal funktion att hämma enzymerna cathepsin B, H, L, K och S. Den aminosyra som bytts ut hos patienter med HCCAA är leucin i position 68 som i stället är glutaminsyreamid (L68Q). Mutationen som leder till L68Q-utbytet förekommer hos alla undersökta patienter men hos inga icke-drabbade individer och måste därför vara ansvarig för sjukdomen. Analys av DNA kan därför användas för att säkert ställa diagnosen HCCAA.



For att kunna behandla HCCAA måste vi försöka förstå hur ett enstaka aminosyrautbyte hos cystatin C kan orsaka amyloid-deponering och tidig död i hjärnblödning hos de drabbade individerna. Detta har varit målet med mitt avhandlingsarbete. Om denna mekanism kunde utrönas skulle inte endast behandlingsmöjligheter kunna öppna sig för patienter med HCCAA, utan kanske även för patienter med andra amyloidos-sjukdomar, som t.ex. Alzheimers sjukdom.



I avhandlingens delarbete I, studerade vi hur cystatin C-genen regleras, med förhoppningen att finna sätt att nedreglera produktionen av L68Q cystatin C. Men när vi odlade celler (HeLa-celler) tillsammans med biologiska mängder av steroiden dexametason ökade produktion av cystatin C med nästan 80%. Det ser ut som steroider påverkar cystatin C-genen indirekt, genom att påverka produktionen av andra proteiner som i sin tur påverkar cystatin C-genen. Vilka proteiner det gäller är inte känt. För att kunna bedöma betydelsen av detta, måste vi undersöka cystatin C-halter i olika biologiska vätskor hos personer som har ökade mängder dexametason i kroppen.



För att kunna jämföra olika egenskaper hos L68Q cystatin C och normalt cystatin C, studerade vi i delarbeten II-IV olika celler som producerar cystatin C.



I delarbete II studerade vi cystatin C i monocyter (blodceller) som vi extraherade från HCCAA-patienter och jämförde det med cystatin C i monocyter från normala blodgivare. Vi kom fram till att cellulära transporten av L68Q cystatin C sannolikt är påverkad, eftersom mindre mängder av cystatin C utsöndras från HCCAA-patienters celler. Alla patienter är heterozygoter när det gäller cystatin C (kan producera både normalt cystatin C och L68Q cystatin C), därför var det svårt att säga om cellerna från patienterna utsöndrade båda proteintyperna (L68Q och normalt cystatin C) eller om det är bara det normala proteinet som kommer ut och variant stannar kvar inne i cellen.



För att försöka besvara den frågan förde vi i delarbete III in genen för L68Q cystatin C i musceller (som inte producerar något humant cystatin C) och jämförde med musceller som tillförts gener för normalt humant cystatin C. Vi såg att L68Q cystatin C kan utsöndras men en del av proteinet stannar och ackumuleras i cellen. Om det är ackumulerat L68Q cystatin C eller utsöndrat L68Q cystatin C som deponeras i kärlväggar hos HCCAA-patienter och orsakar hjärnblödning eller båda två, kan vi inte säga något om än så länge.



För att studera om neuroendocrina celler (som det finns många av i hjärnan) är ansvariga för produktion av en stor del av det L68Q cystatin C som bildar amyloid i hjärnan, studerade vi deras omsättning av cystatin C i delarbete IV. Det visade sig att alla undersökta neuroblastomceller, producerade stora mängder av cystatin C jämfört med andra typer av undersökta celler. För att studera omsättningen av L68Q cystatin C i sådana celler satte vi in genen för L68Q-varianten i en typ av neuroblastomcell och jämförde dessa med celler som tillförts genen för normalt humant cystatin C. Det visade sig att celler som tillförts L68Q cystatin C-genen utsöndrade mindre mängder av cystatin C än de som tillförts en extra normal cystatin C-gen. Detta visar att resultaten från delarbete III också gäller för humana celler. Delarbete IV visade också att normalt cystatin C producerat av neuroblastomceller har annorlunda omsättning än cystatin C i andra undersökta celler. Neuroblastomcellers höga cystatin C-koncentration inne i cellen och annorlunda omsättning av proteinet kan ha betydelse för processen som leder till amyloid-deponering av L68Q cystatin C i blodkärlens väggar hos HCCAA-patienter.



Vi och andra har visat att L68Q cystatin C kan utsöndras från odlade celler men L68Q cystatin C har aldrig påvisats i biologiska vätskor från HCCAA-patienter. I delarbete V, undersökte vi om det går att hitta L68Q cystatin C i blod eller spinalvätska från HCCAA-patienter. Blod och spinalvätska innehåller väldigt många proteiner, därför var det svårt att rena fram cystatin C som fanns i dessa vätskor. Vi kunde slutligen hitta L68Q cystatin C i blod men inte i spinalvätska från HCCAA-patienter. Detta bevisar att normalt utsöndras L68Q cystatin C ut i kroppsvätskor. Anledningen till att det inte gick att hitta L68Q cystatin C i spinalvätska kan vara att proteinet redan har aggregerat och deponerats.

• author: Bjarnadóttir, María
• supervisor: [unknown] [unknown]
• opponent: Professor Theodorsson, Elvar, Avd. för klinisk kemi, Linköpings Universitet
• organization: Division of Clinical Chemistry and Pharmacology
• publishing date: 2000
• type: Thesis
• publication status: published
• subject: Medicinal Chemistry; Pharmacology and Toxicology
• keywords: cysteine proteinase inhibitor, brain haemorrhage, amyloid, cystatin C, HCCAA, Clinical chemistry, Klinisk kemi
• pages: 140 pages
• defense location: Segerfalksalen, Wallenberg Neurocentrum, Sölvegatan 33, Lund
• defense date: 2000-09-23 10:15:00
• external identifiers: other:ISRN: LUMEDW/MECL-1017-SE
• language: English
• LU publication?: yes
• id: ffbe0984-9ff6-4cd6-a34a-8872778ff4aa (old id 40709)
• date added to LUP: 2016-04-04 10:12:34
• date last changed: 2018-11-21 20:57:27