Fibromodulin and chondroadherin in connective tissue homeostasis

Abstract

Connective tissue contains a prominent extracellular matrix (ECM), which provides for physiological and

mechanical properties. Intra- and inter-molecular interactions between proteins in this ECM provide for the

formation of molecular networks. These interactions determine the shape of the tissue as well as cell behavior.

This thesis is focused on the leucine-rich repeat proteoglycans fibromodulin and chondroadherin and their

interactions with other proteins in the ECM.

The N-terminal domain of fibromodulin has a highly negative charge due to the presence of the posttranslational

modification of O-sulfate on tyrosine residues. We hypothesized that this domain could mimic heparin binding to

proteins containing domains with clusters of basic amino acids. Interactions to synthetic peptides with heparin

binding properties, representing the basic domains of the ECM proteins chondroadherin and PRELP and the

cytokine oncostatin M were identified. Additional interactions were found with the heparin binding proteins

MMP-13, basic FGF, type IX collagen, thrombospondin-1 and interleukine-10. Fibromodulin can then function as

a linker in the ECM, binding proteins containing basic domains through its N-terminal domain and other proteins,

e.g. collagen. This may determine the appearance and properties of the collagen network. Fibromodulin may also

function to sequester proteases and bioactive molecules in the matrix.

Further, other functions of this domain were found. Presence of the domain enhanced the overall affinity of fulllength

fibromodulin to collagen and it positively regulated collagen fibril formation in vitro. The regulatory role

was evaluated by electron microscopy that showed involvement of the domain in the fine-tuning of collagen

molecules assembly into highly organized fiber structures.

The C-terminal domain of chondroadherin contains a cluster of basic amino acids, which besides binding

fibromodulin, binds heparin. This thesis describes interaction of this domain with heparan sulfate chains attached

to a cell surface proteoglycan. Upon binding this short peptide stimulated bound chondrocytes to spread and

increased the attachment through integrins, which resulted in the formation of focal adhesions. Further, the short

peptide elicited cell signaling via the MAPK/ERK signaling pathway. Chondroadherin exists in two forms, where

one of the forms represents a cleavage product that lacks the last nine amino acids, i.e. including the heparin

binding site. This cleavage may play an important role in tissue homeostasis through feedback regulation to the

cell.

Finally, the integrin binding sequence of chondroadherin was identified by protease digestion of the protein

followed by mass spectrometry. The domain was shown to be located in one of the C-terminal disulfide loop

structures. Cells adhered to a peptide containing the integrin binding site remain rounded, but yet rapidly induced

MAPK/ERK signaling pathway. Thus, binding may be central for maintaining the chondrocyte phenotype and

homeostasis of adult cartilage, e.g. through release of growth factors, proteases and molecules for matrix

assembly.

This thesis describes biologically active domains of the protein fibromodulin and chondroadherin. Binding of the

described domains to other molecules is proposed to be important for the ECM assembly and how cells

communicate with the surrounding extracellular matrix.

Abstract (Swedish)

Popular Abstract in Swedish

Syftet med studierna i denna avhandling har i huvudsak varit att förstå funktion för de

två proteinerna fibromodulin och kondroadherin och deras samspel med övriga

komponenter i bindväven. Dessa två proteiner fungerar som byggstenar och tillhör en

familj av proteiner lokaliserade i bindväven i den så kallade extracellulära matrisen

utanför cellerna.

Bindväv återfinns i olika typer av stödjande vävnad som ben, senor, brosk, hud,

blodkärlsväggar och i den stödjande vävnaden runt om kroppens olika organ.

Uppbyggnaden av de olika vävnaderna ser olika ut beroende på dess funktion och för

att upprätthålla funktionaliteten måste bindväven ha speciella biokemiska egenskaper.

Dessa egenskaper är beroende på sammansättningen av de olika byggstenarna

(molekyler), hur dessa organiserar sig i förhållande till varandra och hur de bygger upp

matrisen.

De huvudsakliga byggstenarna är en grupp av olösliga molekyler som kallas kollagen.

Dessa har förmågan att bilda långa, starka fibrer och bildar nätverk som fungerar som

armering vilka står för hållfastheten i vävnaden. Till dessa nätverk associerar lösliga

proteiner vars närvaro hjälper till att bestämma form och egenskaper på vävnaden.

Fibromodulin och kondroadherin tillhör denna grupp av lösliga proteiner.

I nätverken finns celler som upprätthåller egenskaperna i vävnaden. Cellerna styrs av

signaler från den närliggande extracellulära matrisen via interaktioner till proteiner på

cellytan vilka påverkar syntes av nya molekyler i cellen och uppbyggnad av den

omkringliggande vävnaden.

Alla vävnader byggs inte bara upp en gång, utan det är en ständigt pågående dynamisk

process. Det förekommer en ständig kommunikation mellan cellerna och dess

omgivning där nedbrytning av uttjänta molekyler ger plats åt nya komponenter för att

upprätthålla stabiliteten och formen på vävnaden. Ibland påverkas denna dynamiska

process där balansen mellan uppbyggnad och nedbrytning störs vilket leder till olika

allvarliga sjukdomstillstånd som exempelvis artros.

Mycket forskning är inriktad på att kartlägga och förstå de molekylära processerna vid

olika sjukdomstillstånd. Men för att förstå de bakomliggande destruktiva processerna

är det viktigt att även förstå hur de olika nätverken byggs upp under normala

förhållanden och hur de skapar strukturen och upprätthåller den funktionella helheten.

Identifiering av specifika domäner och egenskaper hos proteinerna som är involverade

i interaktionerna till varandra är en viktig del i denna kartläggning.

Identifiering och isolering av aktiva domäner i proteiner kommer att generera

kraftfulla verktyg som kan användas till att specifikt manipulera och påverka

uppbyggnad/nedbrytning av vävnader.

Två sådana aktiva domäner i proteinet kondroadherin identifieras i denna avhandling.

Den ena domänen återfinns i en loop-struktur i den C-terminala delen av proteinet.

Denna domän binder specifikt till ett protein som finns integrerat med cellytan, den

s.k. α2β1integrinen. Integriner är en familj av proteiner som har förmågan att förmedla

information både utifrån bindväven till insidan av cellen samt inifrån cellen till

omgivningen på utsidan av cellen. Vid bindning av broskceller (kondrocyter) till en

syntetisk peptid motsvarande den identifierade aktiva domänen startar en

signaleringskaskad i cellen som påverkar cellulära funktioner.

Den andra domänen är lokaliserad i den absoluta C-terminala delen av proteinet och

består till största delen av aminosyror med basiska egenskaper. Denna domäns

egenskaper gör att den kan binda till molekyler med motsatt laddning, dvs. negativt

laddade molekyler. I avhandlingen studeras bindning av domänen till laddade

molekyler på ytan av kondrocyter och benceller (osteoblaster). Bindningen visar sig

vara specifik till en speciell negativt laddad sockermolekyl, heparan sulfat, som tillhör

gruppen glykosaminoglykaner. Dessa är alltid kopplade till en proteinkedja, och

tillsammans bildar de en enhet som kallas för en proteoglykan. En funktion för dessa

är att själva eller tillsammans med andra proteiner (t.ex. integriner) förmedla

information till cellens inre. Celler som binder till den integrin-bindande domänen av

chondroadherin i närvaro av den basiska domänen resulterar i en spridning av cellerna

och en ökad inbindning av antalet celler. Även bindning av denna domän leder till en

signaleringskaskad i cellen.

I fibromodulin studeras den N-terminala domänen av proteinet, vilken är starkt

negativt laddad, och bindning till heparinbindande proteiner. Domänen innehåller nio

aminosyror av typen tyrosin. Speciellt med denna aminosyra är att den kan bära en

sulfatgrupp. Åtta av de nio tyrosinerna kan bära en sulfatgrupp. I sekvensen finns även

de negativt laddade aminosyrorna asparaginsyra och glutaminsyra. Tillsammans bildar

alla dessa aminosyror en väldigt negativt laddad molekyl. Domänens egenskaper kan

liknas vid den negativt laddade molekylen heparin och i ett av arbetena visar vi att

denna domän binder till den basiska domänen i de tre extracellulära proteinerna

kondroadherin, PRELP och kollagen IX. Dessa tre proteiner och fibromodulin binder

kollagenfibrer via andra domäner i sina proteinkedjor. Beroende på vilken basisk

molekyl som binder till den negativa domänen i fibromodulin föreslås bestämma

avståndet mellan kollagenfibrerna. Hur tätt de individuella molekylerna sitter på

kollagenmolekylen kan också vara avgörande för hållfastheten och elasticiteten i

vävnaden.

Det finns även andra lösliga molekyler i vävnaden som inte fungerar som byggstenar

utan i stället är budbärare, s.k. ”signaleringsmolekyler” eller cytokiner. Många av

dessa molekyler är positivt laddade och det är känt att när dessa binder till de negativt

laddade glycosaminoglykankedjorna presenteras de för och/eller aktiverar receptorer

på cellytan. Här visas att den N-terminala domänen i fibromodulin också kan binda

dessa positivt laddade molekyler. Funktionen av den bindningen kan vara att hålla

kvar dessa annars mobila molekyler i vävnaden i ett inaktivt tillstånd och vid speciella

tillfällen, exempelvis vid en skada, frisätts dessa och blir tillgängliga för andra

mottagare.

Fortsättningsvis har även funktionen av den N-terminala domänen av fibromodulin i

formeringen av kollagenfibrer studerats. Denna del binder till kollagenmolekylerna

och bidrar till att hela proteinet får en hög bindningstyrkan. Resultaten pekar på att

domänen har en viktig funktion i den initiala fasen i bildandet av kollagenfibrer och

har förmågan att para ihop kollagenmolekylerna så att de hamnar rätt i förhållande till

varandra och välorganiserade fibrer bildas.

Sammanfattningsvis beskrivs i de fyra arbetena biologiskt aktiva domäner i de båda

proteinerna fibromodulin och kondroadherin. Bindning via dessa domäner till andra

molekyler föreslås ha betydelse för hur vävnader formas och för cellers

kommunikation med sin omgivning.

• author: Tillgren, Viveka
• supervisor: Patrik Önnerfjord; Tore Saxne
• opponent: Hardingham, Timothy, Wellcome Trust Centre for Cell-Matrix Research, Faculty of Life Science, University of Manchester, UK
• organization: Rheumatology
• publishing date: 2013
• type: Thesis
• publication status: published
• subject: Rheumatology and Autoimmunity
• keywords: Collagen, integrin, cell surface proteoglycan, extracellular matrix, and small leucine-rich repeat proteoglycan.
• in: Lund University Faculty of Medicine Doctoral Dissertation Series
• volume: 2013:117
• pages: 138 pages
• defense location: Rune Grubb-salen, BMC, Lund
• defense date: 2013-11-07 09:00:00
• ISSN: 1652-8220
• ISBN: 978-91-87449-90-1
• language: English
• LU publication?: yes
• additional info: The information about affiliations in this record was updated in December 2015. The record was previously connected to the following departments: Connective Tissue Biology (013230151)
• id: 1f6eebb3-9932-40f8-a19e-eab4c882f1a6 (old id 4092186)
• date added to LUP: 2016-04-01 14:39:35
• date last changed: 2019-05-22 04:13:09