Protein kinase C epsilon and neurite outgrowth

Abstract

Protein kinase C (PKC) is a serine/threonine kinase family with 10 identified isoforms. The contribution of PKC isoforms to cell growth and differentiation, with focus on neurite outgrowth, was investigated, using neuroblastoma and immortalised neural cells as model systems. In neuroblastoma cells one or several of the classical PKC isoforms are of importance for driving proliferation, protecting against apoptosis and mediating upregulation of neuronal differentiation markers. Overexpression of the novel isoform PKC epsilon, but not of other classical or novel PKC isoform normally expressed in neuroblastoma and neural cells, induce neurite outgrowth in these cells. This effect is mediated by the regulatory domain and is hence independent of PKC catalytic activity. The C1 domains with surrounding amino acids were found to be the structures that mediate neurite outgrowth. The fact that neurites are induced in both cell types indicate that neurite induction by PKC epsilon might be a general phenomenon in neuronal cells. Several structures, both in the regulatory and the catalytic domain, are necessary for PKC epsilon-specific neurite induction, including an F-actin-binding site situated between the C1 domains of PKC epsilon. Inhibitory fragments derived from PKC epsilon suppressed both PKC epsilon, retinoic acid and growth factor-induced neuritogenesis, suggesting that PKC epsilon may be of importance for neurite outgrowth during neuronal differentiation. Optimal neurite induction by PKC epsilon requires membrane localisation and/or association to the cortical cytoskeleton, shown by removal decreased neurite induction by a PKC epsilon variant without an F-actin-binding site and increased neurite inducing potential by myristoylated PKC epsilon .

Abstract (Swedish)

Popular Abstract in Swedish

För att en flercellig organism ska kunna fungera krävs det att alla celler har en förmåga att svara på och anpassa sig till förändringar i dess inre och yttre miljö. För att kunna uppfylla detta krav utnyttjar cellerna utnyttjar ett komplext nätverk av signaleringsvägar där många av cellens enzymer och andra proteiner ingår. Proteinkinas C (PKC) är en enzymfamilj som består av hittills tio identifierade medlemmar, så kallade isoformer. PKC-isoformerna har en gemensam övergripande struktur med en regulatorisk och en katalytisk del, men skiljer sig med avseende på vissa av de mindre strukturer som bygger upp PKC, och klassificeras därför antingen som klassiska, nya eller atypiska isoformer. De olika isoformerna är också olika känsliga för olika ämnen som aktiverar PKC. Vid aktivering förflyttas PKC till andra platser i cellen, ofta till cellens yttre barriär, membranet. Dessutom sker en strukturförändring sker som gör att PKC kan utföra sin enzymatiska aktivitet och förändra sitt substrat, som ofta är ett annat enzym. Detta leder vanligen leder till aktivering av substratet. PKC är involverat i många viktiga biologiska processer som t. ex. tillväxt, celldöd och differentiering (mognad till en specialiserad cell) av flera vävnader och celltyper. Att identifiera funktionen hos enskilda PKC isoformer har visat sig vara komplicerat. Flera isoformer finns i samma cell och kan ha olika eller till och med motsatta effekter. Det verkar inte heller finnas någon större selektivitet för substraten in vitro. Detta antyder att andra mekanismer måste avgöra specificiteten inom PKC familjen. Det är troligt att PKC-isoformernas lokalisering i tid och rum till olika strukturer i cellen och tillgängligheten av aktivatorer, substrat och interagerande proteiner vid dessa strukturer avgör isoformens specifika funktion i just den celltypen. Trots att den första PKC-isoformen upptäcktes för snart 25 år sedan är det först under de senaste åren som isoform-specifika funktioner börjar kunna identifieras. Syftet med denna avhandling har varit att undersöka betydelsen av enskilda isoformer för celltillväxt och differentiering och med fokus på utväxt av neuriter, nervcellernas trådlika utskott. Som modellsystem har neuroblastomceller och neurala stamceller från hjärna använts. Neuroblastom är en barntumör som uppkommer i det sympatiska nervsystemet. Neuroblastomceller kan anses ha stannat i ett omoget utvecklingsstadie och fortsätter därför att dela sig och växa trots att de borde ha mognat ut till icke-delande nervceller. Celler isolerade från tumörer kan odlas i laboratoriet där man med hjälp av tillväxtfaktorer och andra ämnen kan få cellerna att differentiera. Neurala stamceller, som ger upphov både till nervceller och andra celltyper, kan under vissa omständigheter differentieras i laboratoriet men kan också transplanteras in i hjärnan igen och där fullfölja sitt differentieringsprogram som avbröts när de isolerades. Under neuronal differentiering förändras cellen både morfologiskt genom utväxt av neuriter och biokemiskt genom att cellen ställer om sig till att producera de proteiner som behövs för att nervcellen ska kunna utföra sin uppgift. För att kunna undersöka funktionen av enskilda PKC isoformer har måste man först veta vilka isoformer som finns i cellerna man arbetar med. I delarbete I och IV visar vi att samma PKC isoformer finns i neuroblastomcellinjer och tumörer samt den i neurala stamcellslinjen RN33B. Genom att använda olika ämnen som hämmar PKCs enzymaktivitet och studera deras effekt på neuroblastomcellers tillväxt erhölls resultat som antyder att det är en eller flera av de klassiska PKC isoformerna som både driver celltillväxt och motverkar celldöd i dessa celler. För att noggrannare undersöka olika PKC-isoformers roll förhöjde vi nivåerna av enskilda isoformer i neuroblastom- och RN33B-celler. I båda celltyper observerades en tydlig morfologisk förändring i form av neuritutväxt i celler med ökade nivåer av PKC epsilon i (delarbete II och IV). Effekten av PKC epsilon var oberoende av dess enzymatiska aktivitet och kunde dessutom också utföras av en mindre del av den regulatoriska delen, som alltså medierade effekten (delarbete II). Detta betyder att PKC epsilon kan utöva biologiska effekter via två mekanismer, där bara den ena är beroende av PKCs enzymaktivitet. Våra fynd stöds av andra rapporter som visar att PKC epsilon har effekter i andra cellsystem som medieras av den regulatoriska delen och allstå inte av dess katalytiska aktivitet. Trots att PKC epsilon var den enda isoform som inducerade neuritutväxt, fick celler som producerade den isolerade regulatoriska delen från en annan PKC isoform, PKC delta, också utskott. Det måste allstå finnas strukturer i PKC epsilon som bidrar till att endast PKC epsilon kan inducera neuriter och alltså ger PKC epsilon specificitet till neuritutväxten. För att undersöka vilka dessa strukturer var, konstruerades PKC epsilon-varianter där vissa strukturer tagits bort samt kombinationsvarianter där delar från PKC epsilon ersatts med motsvarande delar från PKC delta. Vi identifierade flera strukturer, både i den regulatoriska och katalytiska delen som är nödvändiga för att ge PKC epsilon -effekten isoform-specificitet (delarbete III och IV). Dessutom såg vi att två fragment från PKC epsilon hämmade neuritutväxt, både sådan som inducerades av ökade PKC epsilon-nivåer och den som sker under differentiering. Troligen verkar dessa hämmande fragment genom att binda till de strukturer i cellen som PKC epsilon måste interagera med för att utöva sin neuritinducerande effekt (delarbete II, III). Detta antyder att PKC skulle kunna mediera neuritutväxt som sker under fysiologiska förhållanden. Vi visar också att för att uppnå optimal neuritinduktion måste PKC epsilon vara associerat till membranet och troligen även vara i närheten av det kortikala cytoskelettet, den struktur som finns under membranet och som bidrar till att ge cellen dess form (delarbete III). Slutsatserna av resultaten i denna avhandling är att PKC epsilon kan inducera neuritutväxt och att den neuritutväxt som sker under differentiering av neuronala celler kan vara beroende av PKC epsilon . Neuritutväxten medieras av strukturer i den regulatoriska delen. PKC epsilon måste dessutom vara lokaliserat till rätt strukturer i cellen för att kunna utöva denna effekt. Ökad kunskap om olika PKC isoformers effekter kan vara viktig för utvecklandet av behandlingar mot flera sjukdomar. Vetskapen om vilka isoformer som driver celltillväxt och vilka som motverkar celldöd är värdefull för förbättrandet av neuroblastomterapi och kännedom om vilka faktorer som styr neuritutväxt kan ha betydelse för utvecklandet av behandling av neuronala sjukdomar eller skador där nervbanor förstörts.

• author: Zeidman, Ruth
• supervisor: [unknown] [unknown]
• opponent: Dr Kazanietz, Marcelo G, University of Pennsylvania, Philadelphia, USA
• organization: Division of Molecular Medicine and Gene Therapy
• publishing date: 2001
• type: Thesis
• publication status: published
• subject: Cancer and Oncology
• keywords: Medicine (human and vertebrates), Medicin (människa och djur)
• pages: 110 pages
• defense location: Medicinskt forskningscentrum, Lilla aulan, University Hospital MAS, Malmö
• defense date: 2001-05-18 10:15:00
• ISBN: 91-628-4777-5
• language: English
• LU publication?: yes
• additional info: The information about affiliations in this record was updated in December 2015. The record was previously connected to the following departments: Molecular Medicine (013031200), Division of Molecular Medicine and Gene Therapy (013022010)
• id: d2143c86-7068-4f89-ad91-93306c8ff27a (old id 41511)
• date added to LUP: 2016-04-04 10:16:01
• date last changed: 2018-11-21 20:57:47