Treatment of Skin Wounds with Cell Transplantation and Gene Transfer

Abstract

Background: A large number of different wound coverings have been used in order to improve the wound microenvironment, and thus accelerate repair. Since almost two centuries, clinicians and researchers have developed techniques for skin transplantation. In the past several decades, growth factors have been used as tools for accelerating and modifying skin wound repair. The experimental work in this thesis has the goal of improving wound repair in these areas.



Methods: In a porcine wound model, flexible transparent wound chambers containing saline or a growth medium with antibiotics were used in all experiments, either alone or compared to other dressings. Transplantation of suspensions of keratinocytes and fibroblasts was studied and compared to other transplantation methods. A tetracycline-inducible regulatory switch for controlling transgene expression was developed and tested in vitro and in vivo.



Results: Wound healing in a liquid environment was faster as compared to dry and moist conditions. Transplantation of wounds with suspensions of keratinocytes or fibroblasts further accelerated repair. Transfection with beta-galactosidase confirmed that the transplanted cells could regenerate skin. Cotransplantation of keratinocytes and fibroblasts resulted in synergistic effects on epidermal repair. Transplantation of hEGF gene transfected fibroblasts resulted in significant hEGF expression in tissue and wound fluid. By transplanting cells that had been transfected with the combinations of the tetracycline-operator/hEGF genes and the tetracycline repressor gene, we showed that EGF expression in wounds may be precisely regulated by tetracycline.



Conclusions: It is concluded that the use of the wound chamber allows for the addition of a liquid and transplanted cell suspensions, both of which accelerate healing. The feasibility of targeted regulated delivery of growth factors with ex vivo gene transfer incorporating a tetracycline switch was demonstrated. This provides a very precise tool for the delivery of therapeutic proteins.

Abstract (Swedish)

Popular Abstract in Swedish

Sår som inte läker utgör ett betydande problem för dem som drabbas och för sjukvården i stort. Utebliven eller defekt läkning är ofta ett led i en bakomliggande sjukdom som exempelvis diabetes, förlamningstillstånd eller olika bindvävs- och kärlsjukdomar. Förutom en mycket stor ekonomisk belastning för sjukvården, så innebär det ett stort fysiskt och psykiskt lidande för patienten. Infektioner i såren kan orsaka allmän blodförgiftning (sepsis), och sitter såret på exempelvis ett ben, kan amputation bli nödvändig. För att framgångsrikt behandla sår som inte läker behövs förutom preventiva åtgärder också nya effektivare behandlingsformer. I den här avhandlingen beskrivs utvecklandet av tre behandlingsmöjligheter, sårkammarbehandling, celltransplantation och genöverföring. Huvudsyftet med studien var att öka grundkunskapen med avsikten att utveckla dessa till kliniska behandlingsalternativ.



Sårläkning i fysiologisk vätska: Sår som behandlats i en fuktig miljö läker snabbare och bättre än sår som behandlats torrt. I samtliga studier gick vi ett steg längre och behandlade såren i en fysiologisk (”kroppsnära”) vätskemiljö. Det visade sig att vätskebehandlade sår läkte snabbare än torra och fuktiga sår. Att innesluta såren i en vätska förenklar också transplantering av sår med celler i suspension (celler fritt i en lösning) eftersom de mycket känsliga cellerna då inte kan förstöras genom uttorkning. I studien transplanterades alla sår med sådan teknik. Dessutom fungerar systemet som ett forskningsverktyg som tillåter icke invasiva analyser av sårläkningsförloppet genom att mäta exempelvis halten av proteiner och tillväxtfaktorer i sårvätskan. I studien utnyttjade vi detta till att följa reepitelialiseringen (överhudsläkningen) av såren samt till att mäta produktionen av tillväxtfaktor efter genöverföring. Systemet medger även lokal tillförsel av medikamenter, såsom antibiotika, till såret. Detta utnyttjades för att styra tillväxtfaktorproduktionen med ett reglerläkemedel efter genöverföring till såret.



Cellterapi: Celler utgör kroppens ”minsta byggstenar” och kan i många fall odlas utanför kroppen. Detta innebär näst intill obegränsad tillgång till ny vävnad. I avhandlingen studeras behandling av sår genom transplantation av odlade celler. Vi transplanterade sår dels med överhudsceller (keratinocyter), dels med läderhudsceller (fibroblaster) och slutligen, med kombinationer av de båda cellslagen. Vi fann att alla celltyper accelererade sårläkningen och att kombination av celltyperna hade en synergistisk effekt på sårläkningen. Effekten på sårläkning med odlade överhudsceller var också större än med celler som isolerats direkt från hud utan odling. Icke odlade celler medgav dock en tidsvinst eftersom odlingsstadiet, omfattande cirka 2-4 veckor, kunde uteslutas.



Genöverföring: Under det senaste decennierna har mycket forskning ägnats åt så kallade tillväxtfaktorer. Dessa är vanligen små proteiner (äggviteämnen) som cellerna använder sig av för att kommunicera med och påverka andra celler. Flera tillväxtfaktorer har visat sig kunna påskynda eller förbättra sårläkningen i flera olika djurmodeller. I kliniska försök har dock effekterna av tillväxtfaktorer varit relativt blygsamma. Det är möjligt att dålig eller utebliven effekt beror på bristfällig penetration av lokalt tillförd tillväxtfaktor in i sårvävnaden eller nedbrytning av tillväxtfaktorn av enzymer i såret. Ett sätt att undvika sådana problem vore att låta tillväxtfaktorn produceras kontinuerligt i stor mängd på plats i såret. Det kan åstadkommas med överföring av tillväxtfaktorgener till celler i såret. I avhandlingen studerade vi odlade celler som modifierats genetiskt utanför värddjuret och som sedan transplanterades tillbaka till djuret. Vi fann att fibroblaster (läderhudscellerna) effektivt kunde förse sår med en tillväxtfaktor, ”human Epidermal Growth Factor”, under läkningsprocessen. En viktig aspekt av sådan genterapi är också behovet av att kunna reglera produktionen (genuttrycket) av tillväxtfaktorn under behandlingen samt, att då terapin är avslutad, kunna stänga av densamma. I avhandlingen utvecklades och testades framgångsrikt ett nytt sådant system för kontroll av genuttrycket.



Sammanfattningsvis har vi utarbetat och noggrant studerat ett kammarsystem för behandling av sår. Med dess hjälp kan vi transplantera hudsår med odlade hudceller. Genom att kombinera olika typer av hudceller ökade vi effektiviteten av transplantationen. Genom att genetiskt modifiera de transplanterade cellerna att producera en tillväxtfaktor så demonstrerades även möjligheten till genterapi av såret. För säker genterapi krävs även reglering av genprodukten vilket vi visade var möjligt genom lokal tillförsel av ett reglerläkemedel till såret. Resultaten kan ha betydelse för behandlingen av svåra sår som exempelvis brännskador, bensår och liggsår.

• author: Svensjö, Tor
• supervisor: [unknown] [unknown]
• opponent: Associate professor Kratz, Gunnar, Department of Plastic and Reconstructive Surgery, Karolinska sjukhuset, Stockholm
• organization: Faculty of Medicine
• publishing date: 2001
• type: Thesis
• publication status: published
• subject: Surgery
• keywords: pigs, gene regulation, cell culture, fibroblasts, keratinocytes, wound healing, skin, gene transfer, Transplantation, gene therapy, Surgery, orthopaedics, traumatology, Kirurgi, ortopedi, traumatologi
• pages: 171 pages
• defense location: Kirurgiska klinikens föreläsningssal, Entrance 42, 1st floor, Malmö University Hospital, Malmö, Sweden
• defense date: 2001-10-15 09:00:00
• ISBN: 91-89625-06-4
• language: English
• LU publication?: yes
• additional info: The information about affiliations in this record was updated in December 2015. The record was previously connected to the following departments: Faculty of Medicine (000022000), Reconstructive Surgery (013240300)
• id: 2d0bee61-49fd-489e-8c05-48149089d75d (old id 41854)
• date added to LUP: 2016-04-04 11:48:16
• date last changed: 2018-11-21 21:07:19