Advanced

Separation of Glycoproteins using Shielding Boronate Affinity Chromatography

Li, YuCai (2001)
Abstract (Swedish)
Popular Abstract in Swedish

Denna avhandling beskriver arbetet med att finna en effektiv metod för att rena glykoproteiner. Glykoproteiner är en grupp biomolekyler som består av ett skelett av protein där ett antal socker-molekyler är fästa. Glykoproteiner finns i alla virus, mikroorganismer, växter och djur. Där består deras uppgifter bland annat i att bilda strukturelement som cellväggar, de fungerar som transport-proteiner i blod och de har viktiga igenkänningsfunktioner för virus och hormoner i cellväggar. Glykoproteiner spelar alltså en mängd viktiga roller när det gäller cellers grundfunktioner, men även när det gäller cellernas försvar mot sjukdomar. Kunskapen som vunnits under avhandlings-arbetet kan.följaktligen... (More)
Popular Abstract in Swedish

Denna avhandling beskriver arbetet med att finna en effektiv metod för att rena glykoproteiner. Glykoproteiner är en grupp biomolekyler som består av ett skelett av protein där ett antal socker-molekyler är fästa. Glykoproteiner finns i alla virus, mikroorganismer, växter och djur. Där består deras uppgifter bland annat i att bilda strukturelement som cellväggar, de fungerar som transport-proteiner i blod och de har viktiga igenkänningsfunktioner för virus och hormoner i cellväggar. Glykoproteiner spelar alltså en mängd viktiga roller när det gäller cellers grundfunktioner, men även när det gäller cellernas försvar mot sjukdomar. Kunskapen som vunnits under avhandlings-arbetet kan.följaktligen utnyttjas inom bioteknik- och läkemedelssektorn.



Glykoproteiner har mycket komplicerad struktur. Först och främst kan proteinskelettet variera. Dessutom har glykoproteiner många olika glykoformer, d.v.s. två glykoproteiner med samma proteinskelett men med små skillnader i de påhängda sockermolekylerna. Olika glykoformer kan visa helt olika funktion. Skillnader i sockermolekylerna kan t.ex. vara vilken sorts sockerart de är, hur många sockermolekyler som är fästa vid skelettet, och var på proteinskelettet de är fästa. Dessa små skillnader i struktur gör det svårt att separera (rena) olika glykoproteiner från varandra, och därmed är det svårt att genomföra undersökningar som visar exakt vilken effekt ett speciellt glyko-protein har. Om man vill genomföra undersökningar som påvisar effekten ett visst glykoprotein har måste man alltså ha tillgång till detta protein i ren form.



Det finns för närvarande två metoder att rena glykoproteiner. Båda metoder utnyttjar den attraktion (affinitet) glykoproteinernas olika delar visar gentemot vissa material. En av dem, boronataffinitetskromatografi (BAC), bygger på att sockerdelarna av ett glykoprotein temporärt binds till boronatgrupper på ett fast material, en bärare. Ett problem är dock att vissa delar av proteinskelettet kan fästa (om än svagt) vid boronatgrupperna. Därmed riskerar man att även andra, vanliga, proteiner fastnar på bäraren, och därför är denna separationsmetod inte alltid så effektiv som man önskar. I denna avhandling visas att man kan öka metodens effektivitet drastiskt genom att använda ett tredje ämne som en sköld mot glykoproteiners proteinskelett, samtidigt som sockerdelarna inte skärmas av från bäraren.



I avhandlingen återfinns en introduktion till glykoproteiner, både vad gäller deras olika strukturer och funktioner. Därefter beskrivs ett antal generella metoder för att rena och strukturbestämma glykoproteiner. En sammanfattning av det experimentella arbete som utförts handlar dels om hur ett modellsystem framtagits för att pröva denna nya teknik, skärmande boronataffinitetskroma-tografi (SBAC), och dels hur tekniken ska användas. Modellsystemet som använts består av syntetiska och välkända glykoproteiner med vars hjälp tekniken utvecklats och raffinerats. Vidare visas hur den nya tekniken använts vid separation av olika glykoformer av två naturliga glyko-proteiner, mistel-lektin och glykohemoglobin. Avhandlingen visar att den nyuppfunna tekniken kan bli ett mycket värdefullt verktyg inom bioteknik- och läkemedelsvetenskapen. (Less)
Abstract
Glycoproteins, a class of biomolecules, exhibit a variety of biological activities and therefore are of importance in modern biotechnology and pharmaceutical industry. Pure glycoproteins are needed for structural and functional studies. However, the separation of glycoproteins has been a problem until now due to their structural complexity. Efficient separation techniques are thus required.



This thesis presents a novel technique, shielding boronate affinity chromatography (SBAC), which eliminates non-specific boronate–protein interactions via introducing a so-called shielding reagent into the mobile phase. To be a suitable shielding reagent, the following requirements need to be fulfilled: (1) the shielding reagent... (More)
Glycoproteins, a class of biomolecules, exhibit a variety of biological activities and therefore are of importance in modern biotechnology and pharmaceutical industry. Pure glycoproteins are needed for structural and functional studies. However, the separation of glycoproteins has been a problem until now due to their structural complexity. Efficient separation techniques are thus required.



This thesis presents a novel technique, shielding boronate affinity chromatography (SBAC), which eliminates non-specific boronate–protein interactions via introducing a so-called shielding reagent into the mobile phase. To be a suitable shielding reagent, the following requirements need to be fulfilled: (1) the shielding reagent should have an affinity to the boronate ligand and should not interact with the sample molecules to be purified; (2) the boronate–shielding reagent interactions must be stronger than non-specific boronate–protein interactions, while weaker than specific boronate-glycoprotein interactions; and (3) the shielding reagent should be non-toxic and chemi-cally stable in order to be applied to pharmaceutical industry. The shielding efficiency of a shiel-ding reagent is correlated to its chemical structure. Low-molecular-mass polyhydroxyl compounds with a conformation that allows the formation of tridentate complexes with the boronate anion exhibit the highest shielding efficiencies. Such compounds can also function as eluting agents when used at high concentrations.



The feasibility of using SBAC to the separation of glycoproteins is demonstrated through several examples, such as (1) separation of a neoglycoprotein, maltose-modified Cht (Cht-Mal), from non-glycosylated Cht; (2) separation of Cht-Mal into individual fractions with different degrees of glycosylation; (3) separation of two mistletoe lectins from each other based on their degree of glycosylation; and (4) separation of glycated haemoglobin (GHb) from non-glycated Hb species as well as separation of GHb into two fractions that exhibit different glycation patterns. The study shows that SBAC has higher separation resolution than conventional boronate affinity chromatography. (Less)
Please use this url to cite or link to this publication:
author
opponent
  • Ohlson, Sten
publishing date
type
Thesis
publication status
published
subject
keywords
affinity chromatography, boronate, chymotrypsin, haemoglobin, mistletoe lectin, neoglycoprotein, glycosylation, shielding, Biotechnology, Bioteknik, Pharmaceutical and related technologies, Läkemedelsteknik och relaterad teknik
pages
105 pages
publisher
Biotechnology, Lund University
defense location
Sölvegatan 41 "Nils Alwall" conference room
defense date
2001-12-07 13:15
external identifiers
  • Other:ISRN: LUTKDH/TKBT-01/1054--SE
ISBN
91-628-4929-88
language
English
LU publication?
no
id
50365cea-9582-4038-a999-6409fae0cb74 (old id 42187)
date added to LUP
2007-08-01 13:10:20
date last changed
2016-09-19 08:45:03
@phdthesis{50365cea-9582-4038-a999-6409fae0cb74,
  abstract     = {Glycoproteins, a class of biomolecules, exhibit a variety of biological activities and therefore are of importance in modern biotechnology and pharmaceutical industry. Pure glycoproteins are needed for structural and functional studies. However, the separation of glycoproteins has been a problem until now due to their structural complexity. Efficient separation techniques are thus required.<br/><br>
<br/><br>
This thesis presents a novel technique, shielding boronate affinity chromatography (SBAC), which eliminates non-specific boronate–protein interactions via introducing a so-called shielding reagent into the mobile phase. To be a suitable shielding reagent, the following requirements need to be fulfilled: (1) the shielding reagent should have an affinity to the boronate ligand and should not interact with the sample molecules to be purified; (2) the boronate–shielding reagent interactions must be stronger than non-specific boronate–protein interactions, while weaker than specific boronate-glycoprotein interactions; and (3) the shielding reagent should be non-toxic and chemi-cally stable in order to be applied to pharmaceutical industry. The shielding efficiency of a shiel-ding reagent is correlated to its chemical structure. Low-molecular-mass polyhydroxyl compounds with a conformation that allows the formation of tridentate complexes with the boronate anion exhibit the highest shielding efficiencies. Such compounds can also function as eluting agents when used at high concentrations.<br/><br>
<br/><br>
The feasibility of using SBAC to the separation of glycoproteins is demonstrated through several examples, such as (1) separation of a neoglycoprotein, maltose-modified Cht (Cht-Mal), from non-glycosylated Cht; (2) separation of Cht-Mal into individual fractions with different degrees of glycosylation; (3) separation of two mistletoe lectins from each other based on their degree of glycosylation; and (4) separation of glycated haemoglobin (GHb) from non-glycated Hb species as well as separation of GHb into two fractions that exhibit different glycation patterns. The study shows that SBAC has higher separation resolution than conventional boronate affinity chromatography.},
  author       = {Li, YuCai},
  isbn         = {91-628-4929-88},
  keyword      = {affinity chromatography,boronate,chymotrypsin,haemoglobin,mistletoe lectin,neoglycoprotein,glycosylation,shielding,Biotechnology,Bioteknik,Pharmaceutical and related technologies,Läkemedelsteknik och relaterad teknik},
  language     = {eng},
  pages        = {105},
  publisher    = {Biotechnology, Lund University},
  title        = {Separation of Glycoproteins using Shielding Boronate Affinity Chromatography},
  year         = {2001},
}