Enterostatin - target proteins and intracellular mechanisms. Function in food intake and energy metabolism

Abstract

Hunger and satiety are the results of complex neural events that involve several neurotransmitters and peptides. Enterostatin is an appetite-regulating peptide released in the intestine in response to fat ingestion. Enterostatin specifically decreases fat intake, but has also metabolic effects like inhibition of insulin secretion. Enterostatin has both central and gastrointestinal site of action, although the gastrointestinal action is dependent on vagal transmission. The target and cellular mechanisms has however not been elucidated. In this thesis, a possible target protein for enterostatin has been found in a neuronal cell line and further identified in rat brain membranes. The target protein was identified as the beta-subunit of the F1F0-ATP synthase. Furthermore, the binding of enterostatin to the protein was verified in pure F1F0-ATP synthase and was also confirmed in the insulin producing cell line INS-1. In INS-cells, the targeting of enterostatin resulted in perturbed ATP synthesis, enhanced heat production and increased oxygen consumption. Enterostatin was also shown to decrease the insulin secretion in these cells. This indicates that enterostatin is involved in the regulation of energy metabolism within the cell. The binding of enterostatin to F1-ATPase was inhibited by µ-opiates, i.e. beta-casomorphin, but not by a kappa-opiate. The inhibition of high-fat food intake by low doses of intravenous injection of enterostatin was abolished by simultaneous equimolar administration of beta-casomorphin. Higher doses of enterostatin instead increased the high-fat food intake, and there was a synergistic increase on food intake together with beta-casomorphin. The association between insulin secretion and uncoupling protein-2 (UCP2) expression was compared in INS-1 cells after long-term exposure to oleic acid. It was concluded that fatty acid-induced increase in UCP2 expression is not always associated with decreased insulin secretion.

Abstract (Swedish)

Popular Abstract in Swedish

De flesta människor bibehåller en relativt konstant kroppsvikt genom livet trots att mängden mat och motion varierar från dag till dag. En konstant kroppsvikt betyder att energiintag (mat och dryck) och energiutgifter (värme och rörelse) i genomsnitt är lika stora, d.v.s. kroppens energibalans är i jämvikt. Övervikt är ett resultat av positiv energibalans, vilket innebär att energiintaget varit större än energiåtgången under en längre tid och att energiöverskottet har lagrats som fett (triglycerider) i kroppens fettväv. Förmågan att lagra överskottsenergi i form av fett har varit genetiskt fördelaktigt när tider av överflöd varvats med svältperioder. Det har medfört att det finns starka regleringssystem och försvars-mekanismer mot undernäring och viktnedgång, medan försvarsmekanismerna mot övervikt är mycket svagare. De senaste decennierna har övervikt och fetma utvecklats till en global epidemi. Detta dilemma är inte längre begränsat till västvärlden utan också i u-länderna är fetma ett växande problem. Orsaken till denna snabbt ökande fetma är att våra gener inte är anpassade för vår livsstil med allt mer stillasittande i kombination med lättillgänglig och kaloririk mat. Fetma är till ca 40 % ärftligt. Det finns ingen specifik fetma-gen utan ett flertal gener verkar kunna spela roll vid utvecklingen av fetma. Aktuella gener reglerar så väl lagring av fett, reglering av energiåtgång och reglering av aptit och mättnad. Övervikt och fetma är starkt relaterat till många olika sjukdomstillstånd såsom typ 2 diabetes och hjärt- och kärl- sjukdomar. Aptiten är ett komplicerat samspel mellan många olika faktorer. Signaler i nervsystemet, t.ex. efter syn, lukt eller tanke på mat, stimulerar till måltid. Under måltiden uppstår mättnad när näringsämnena når magsäcken och tunntarmen. Detta signaleras via nervsignaler och hormoner som utsöndrats som svar på måltiden. Flera psykologiska faktorer är också inblandade vid mättnad. Synen och doften av mat är inte längre lockande i slutet av en måltid. När maten så småningom är nedbruten och näringsämnena kommer ut i blodbanan inträffar den andra fasen i mättnaden. Denna fas pågår fram till dessa näringsämnen är slut och man får förnyad aptit och inleder en ny måltid. Näringsämnena tas upp från blodet till kroppens celler där de bryts ner ytterligare till den slutgiltiga energirika molekylen ATP, som är nödvändig för alla energikrävande processer i cellerna. Den energimängd som bildas i form av ATP överensstämmer inte helt med den mängd energi vi fått i oss via födan eftersom en del energi ”läcker” ut i form av värme. Det finns specifika proteiner som kallas urkopplande proteiner (UCP) som utför detta ”energi-läckage” och på så sätt ökar energiomsättningen, och det bildas då värme istället för ATP. Dessa värmeproducerande proteiner finns framför allt i brun fettväv och kallas UCP1. Man har nyligen funnit liknande proteiner i kroppens övriga vävnader, dessa benämns UCP2 t.o.m. UCP5. Funktionen av dessa proteiner är emellertid ännu inte fastställd, men de verkar inte ha samma värmeproducerande förmåga som UCP1, även om de på olika sätt verkar vara inblandade i energiomsättningen. Reglering av födointaget och energibalansen består dels av en kortsiktig reglering som påverkar t.ex. antalet måltider per dag och måltidens storlek, medan den långsiktiga regleringen balanserar födointaget och energiomsättningen för att upprätthålla kroppens energireservoarer. Det finns ett stort antal kroppsegna substanser som alla påverkar olika delar av dessa regleringssystem. Vissa påverkar intaget av ett specifikt födoämne, t.ex. fett, och ett exempel på en sådan är den kroppsegna peptiden enterostatin. Enterostatin bildas i tunntarmen genom klyvning av procolipas till enterostatin och colipas, som är ett protein som är nödvändigt vid nedbrytning av fett i tarmen. Enterostatin har visat sig minska födointaget, och specifikt fettintaget, hos råttor både efter injektion i hjärnan och perifert i kroppen t.ex. i buken. I hjärnan har enterostatin visat sig ha effekt framför allt i hypotalamus som är hjärnans aptitregleringscentrum. Enterostatin har också andra effekter på energiomsättningen, t.ex. genom att hämma insulinsekretionen från beta-cellerna i bukspottskörteln. Dessutom har enterostatin visat sig kunna öka energiomsättningen hos råttor som äter mat med högt fettinnehåll genom att öka mängden UCP1 och UCP2. Trots att vi vet mycket om effekterna av enterostatin så vet vi fortfarande inte mekanismen bakom eller hur mottagarmolekylen (receptorn) för enterostatin ser ut eller hur den verkar. Tidigare försök har visat att enterostatin binder till hjärnmembraner och att bindningen går att hämma med opiater. Opiater är morfinliknande ämnen som stimulerar vårt belöningssystem. Denna motverkande effekt mellan enterostatin och opiater har också bekräftats i djurförsök där opiater hindrar enterostatinets aptithämmande effekter och istället stimulerar fettintaget. I denna avhandling har jag identifierat en mottagarmolekyl (receptor) för enterostatin, och jag har också studerat vad som händer inne i cellen efter att enterostatin har fäst till denna molekyl. Jag har också undersökt de motverkande effekterna mellan enterostatin och olika opiater såväl i celler som i djurförsök. Dessutom har jag studerat sambandet mellan fettsyror, UCP2 och insulinsekretionen för att försöka förstå funktionen av UCP2 vid utvecklingen av den fetma-relaterade sjukdomen typ 2 diabetes.



I delarbete I fann jag att enterostatin band specifikt till en klonad nervcell. Bindningen av enterostatin var möjlig att hämma genom att tillsätta två olika opiater som båda binder till s.k. my-opiat receptorer. Ett protein som binder specifikt till enterostatin ”fiskades” fram genom att hälla en lösning bestående av proteiner från nervcellerna över en gel på vilken jag fäst enterostatin, och jag kunde på så sätt fiska upp de proteiner i lösningen som bara binder till enterostatin (en metod som kallas affinitets-kromatografi). Efter storleksseparation av dessa proteiner fann jag ett sådant protein. Ett protein med samma storlek kunde också synliggöras genom att blanda radioaktivt märkt enterostatin med cellproteinerna och separera proteinerna med avseende på storlek.



I delarbete II ville jag identifiera det enterostatin-bindande protein jag tidigare funnit. För att få tillräckligt med material använde jag mig av hjärnor från råtta. Membraner från hjärncellerna separerades fram och därifrån renade jag fram de proteiner som sitter bundna i membranen. För att finna det protein som enterostatin binder till använde jag mig återigen av affinitetskromatografi och storleksseparation (se ovan), och fann även nu ett protein i samma storlek. När jag fått fram tillräckligt stora mängder (c:a 100 ng) kunde det överraskande identifieras som en del av ATP-syntas. ATP-syntas är det enzym som bildar ATP i mitokondrien (cellens energikraftverk) och som bär energi med hjälp av energirika bindningar. Identifieringen till ATP-syntas kunde också verifieras genom bindning till ett renat enzym. Bindningen kunde dessutom bekräftas i en insulinproducerande cell-linje, INS-1. Även denna bindning visade sig kunna hämmas med en my-opiat. Enterostatinets bindning till ATP-syntas gav även effekter i INS-1 celler. Vi kunde observera en påverkan på ATP produktionen, en ökad värmeproduktion och en ökad syrekonsumtion, vilket tillsammans tyder på en ökad energiomsättning i cellen. Vi visade också att enterostatin, även i INS-1 celler, kunde hämma insulinsekretionen. Enterostatinets förmåga att öka energiomsättningen visades också i försök på råttor som fick mat med högt fettinnehåll i kombination med enterostatin, och de visade sig då få en ökad energiomsättning.



Bindningsegenskaperna mellan enterostatin och ATP-syntas studerades fortsättningsvis i delarbete III. Bindningen studerades i ett s.k. två-fas system för att kunna bestämma en dissociationskonstant, som är ett mått på bindningsstyrkan. Dissociationskonstanten bestämdes till 170 nM, men i närvaro av my-opiaten beta-casomorfin ökade den till 500 nM, vilket innebär att my-opiaten stör inbindningen av enterostatin till ATP-syntaset. Detta bekräftades dessutom i hjärnmembraner från råtta, där inbindningen av enterostatin delvis kunde hämmas av beta-casomorfin. Den motverkande effekten mellan enterostatin och beta-casomorfin studerades även i en djurstudie. beta-casomorfin som injicerades i blodet visade sig stimulera fettintaget hos råttor medan enterostatin, inom ett begränsat koncentrationsintervall, hämmade fettintaget. Vid samtidig injektion av både enterostatin och beta-casomorfin eliminerades dock effekten. Dessa studier tyder på att enterostatin och my-opiater, åtminstone delvis, verkar via samma regleringsmekanism.



I delarbete IV undersökte vi om den ökning av UCP2 som man ser vid långvarig exponering av fettsyror, som t.ex. vid övervikt, alltid följs av en parallell hämning av insulinsekretionen. INS-1 celler odlades i närvaro av oljesyra i tre dygn, vilket ledde till en ökning av UCP2 mRNA (messenger(budbärar)-RNA, som är en förlaga till proteinet). Denna ökning följdes också som väntat av en hämmad insulinutsöndring. Genom att tillsätta två substanser, forskolin och TNFα, som båda påverkar insulinutsöndringen genom olika mekanismer, ville vi se om vi kunde förändra denna relation mellan UCP2 och insulin. Vi fann att insulinsekretionen som stimulerades av forskolin inte påverkades av det ökade UCP2 uttrycket. Däremot tycktes TNFα kunna motverka den hämningen av insulin som beror på ökat UCP2. Slutsatsen var alltså att ökat UCP2 mRNA inte alltid behöver innebära hämmad insulinutsöndring.

• author: Berger, Karin
• supervisor: [unknown] [unknown]
• opponent: Professor Langhans, Wolfgang, SFIT Zurich, Switzerland
• organization: Insulin Signal Transduction (research group); Molecular Endocrinology (research group); Molecular Nutrition (research group)
• publishing date: 2003
• type: Thesis
• publication status: published
• subject: Basic Medicine
• keywords: ATP, energy metabolism, insulin, uncoupling protein, beta-casomorphin, opiate, SK-N-MC, INS-1, Medicin (människa och djur), Medicine (human and vertebrates), fat intake, F1F0-ATP synthase, appetite, enterostatin, satiety, obesity
• pages: 142 pages
• defense location: Rune Grubb-salen, BMC, Lund
• defense date: 2003-04-25 10:15:00
• ISBN: 91-628-5616-2
• language: English
• LU publication?: yes
• additional info: Article: I. Berger, K., Sörhede Winzell, M. and Erlanson-Albertsson, C. Binding of enterostatin to the human neuroepithelioma cell lineSK-N-MC. Peptides 19 (9), 1525-1531, 1998. Article: II. Berger, K., Sivars, U., Sörhede Winzell, M., Johansson, P., Hellman, U., Rippe, C. and Erlanson-Albertsson, C. Mitochondrial ATP synthase – a possible target protein in the regulation of energy metabolism in vitro and in vivo. Nutritional Neuroscience 5 (3), 201-210, 2002. Article: III. Berger, K., Sörhede Winzell, M., Mei, J. and Erlanson-Albertsson, C. Intravenous enterostatin and beta-casomorphin may use the same receptor system in regulating fat intake. Manuscript Article: IV. Berger, K., Kvist Reimer, M., Gustafsson, M., Ahrén, B. and Erlanson-Albertsson, C. Relation between insulin secretion and fatty acid induced UCP2 expression in INS-1 cells. Submitted manuscript, 2003.
• id: 422a193d-6e30-4da5-a042-05ac4facafe9 (old id 465624)
• date added to LUP: 2016-04-04 10:01:41
• date last changed: 2018-11-21 20:56:18