Ribosomes and subunits from Escherichia coli studied by asymmetrical flow field-flow fractionation

Abstract

In this thesis asymmetrical flow field-flow fractionation (FFF) separations of ribosomes and subunits have been studied. Ribosomal material was prepared from Escherichia coli (E. coli) cells and analyzed by the size separation technique. The five main peaks in the fractograms correspond to transfer RNA (tRNA), unidentified proteins, small subunit, large subunit, and ribosome.



The accuracy of the method was tested by measuring the mass fraction of ribosome and the number of ribosomes per cell. Both parameters changed in an expected manner and changes larger than 5 and 10%, respectively, are significant. Furthermore, the amount of tRNA per cell was determined.



The method has been used for elucidating the effect of Vitreoscilla hemoglobin (VHb) on the translational capacity of the host-cell, E. coli. The expression of hemoglobin increased both the number of ribosomes per cell and the amount of tRNA per cell during oxygen-limited fed-batch cultivation. However, the mass fraction of ribosome was unaffected by the expression of VHb. The increase in the number of ribosomes was accompanied by an increase in the activity of a recombinant marker protein, beta-lactamase.



The use of the separation method in the optimization of protein production by genetically engineered E. coli cells was evaluated. A correlation between protein yield and the number of ribosomes per cell was found. The mass fraction of ribosomes was also correlated to the protein yield. These correlations could be used for eliminating the need of determining the protein yield in optimization studies. Instead, the method development can be performed using asymmetrical flow FFF to determine the ribosomal parameters.

Abstract (Swedish)

Popular Abstract in Swedish

Fältflödesfraktionering-ett verktyg för att optimera genteknisk produktion av proteiner Läkemedel av proteintyp kan i framtiden tillverkas mer kostnadseffektivt. Utbytet av protein maximeras genom att den proteinproducerande bakteriens ribosomer separeras och räknas.



Proteiner i vår vardag Protein kan vara mer än den blodiga biffen eller torskfilén på lunchtallriken. Proteinerna (äggviteämnena) finns i våra kroppar där de bygger upp våra muskler, transporterar syret vi andas, bygger upp huden, skyddar oss mot virus och bakterier och mycket annat. De finns även utanför vår kropp på nära håll i vardagen. Tvättmedel innehåller ofta enzymer (ett slags proteiner) för att lösa upp fettfläckar. De fungerar som katalysatorer. Vi läser ofta i tidningarna att idrottsutövare har använt tillväxthormon som dopingmedel. Detta läkemedel är ett protein. Insulin är ytterligare ett exempel på en medicinsk användning av proteiner.



Genteknisk produktion av proteiner Industriell tillverkning av många proteiner sker idag med hjälp av bakterier. Ritningen för hur ett protein är uppbyggt finns i DNA. För att tillverka ett protein tar man fram DNA-sekvensen och för över den i en bakterie. Bakterierna växer i en kolv med buljong och producerar proteinet som sedan renas fram. För att göra produktionen mera kostnadseffektiv finns det ett stort intresse av att optimera tillverkningen av protein. Ribosomer är cellernas proteinmaskiner. Från DNA-ritningen tillverkar bakterierna en mall som utgörs av en molekyl som heter mRNA (messenger eller budbärar RNA). Råmaterialet till proteinet utgörs av aminosyror som är fästa vid tRNA-molekyler (transfer RNA). I alla celler finns det en mängd proteinmaskiner, ribosomer.



Ribosomerna består av flera olika molekyler, både RNA och proteiner. Dessa bildar dels en liten subenhet (30S) och dels en stor subenhet (50S). Dessa bildar tillsammans den hela ribosomen (70S) runt mallen. Råmaterialet (aminosyror-tRNA) förädlas alltså av ribosomerna till en färdig produkt (protein).



Optimering ger effektiva maskiner Bakterierna tillverkar endast protein när de två subenheterna sitter ihop runt mRNA-molekylen. För effektiv proteintillverkning vill man ha många ribosomer i den aktiva formen (70S) och många 70S per bakterie. För att detta skall uppnås krävs att vi väljer den för bakterierna bästa tillväxtmiljön.



För denna optimering behövs ett mått på hur mycket ribosomer som finns per cell och hur aktiva dessa är. Vi måste alltså kunna räkna de tre olika ribosomenheterna, 30S, 50S och 70S. Ett sätt kan vara att konstruera tre sensorer som var och en bara ger utslag för en av dessa ribosomenheter, doppa ner sensorerna i ett bakterieprov och läsa av svaret. Sensorer som reagerar så selektivt är mycket svåra att tillverka. Så vad står då till buds? Jo, vi kan separera de tre olika ribosomenheterna och därefter räkna dem var för sig. Separationen har tidigare varit mycket tidsödande, men i framtiden kan den ske på ett enklare sätt.



Asymmetrisk tvärflödesfältflödesfraktionering separerar ribosomer och subenheter snabbt En relativt ny separationsmetod, fältflödesfraktionering, är ett snabbt sätt att angripa problemet med att separera subenheter och ribosomer. Principen för separation är enkel. I en tunn (0.1 mm) kanal pumpas en vätska. Denna vätska bildar en parabolisk flödesprofil med den högsta flödeshastigheten i mitten och lägre hastigheter ju närmare kanalens botten man kommer. Vinkelrätt mot denna profil verkar en kraft, som ger subenheterna och ribosomerna en transporthastighet mot botten. Hastigheten är lika för alla ribosomenheter. Däremot är den lilla subenheten mer lättrörlig än den stora och intar därför ett jämviktsläge något högre i kanalen. Här utsätts den för en högre flödeshastighet än den stora subenheten och kommer därför fram till slutet på kanalen fortare. En detektor räknar där hur många små och stora subenheter som fanns i just detta prov. Självklart sker separationen av stor subenhet och ribosom på liknande sätt. Separationerna är klara på mindre än 15 minuter.



I denna avhandling beskrivs användningen av en storleksseparations-metod; asymmetrisk tvärflödesfältflödesfraktionering för att separera ribosomer och subenheter från bakterien Escherichia coli. Metoden kommer att kunna användas för att optimera produktionen av protein i bakterier och i framtiden även i andra typer av celler.

• author: Nilsson, Mikael
• supervisor: [unknown] [unknown]
• opponent: Dr Caldwell, Karin, University of Utah, USA
• organization: Centre for Analysis and Synthesis
• publishing date: 1998
• type: Thesis
• publication status: published
• subject: Analytical Chemistry
• keywords: metabolic engineering, VHb, Vitreoscilla hemoglobin, E. coli, Escherichia coli, separation, subunits, ribosomes, Asymmetrical flow field-flow fractionation, flow FFF, optimization, biotechnological production, Analytical chemistry, Analytisk kemi
• pages: 92 pages
• defense location: Lecture hall D at the Center for Chemistry and Chemical Engineering, Sölvegatan 39, Lund, Sweden
• defense date: 1998-04-08 10:15:00
• external identifiers: other:ISRN: LUTKDH/(TKAK-1017)/1-92 (1998)
• ISBN: 91-628-2844-4
• language: English
• LU publication?: yes
• additional info: The information about affiliations in this record was updated in December 2015. The record was previously connected to the following departments: Analytical Chemistry (S/LTH) (011001004)
• id: 42a949fb-507e-462b-b3c1-c22271bd4d76 (old id 38506)
• date added to LUP: 2016-04-04 11:35:39
• date last changed: 2018-11-21 21:05:52