Streptococcus pyogenes and its interactions with the human host

Abstract

We have found that a set of group A streptococcal strains, primarily associated with skin infections, express surface-associated M proteins that bind plasminogen and plasmin with high affinity. The binding is mediated by a common 13 amino acid internal repeated sequence located in the NH2-terminal surface-exposed portion of these M proteins. It could be demonstrated that plasminogen, absorbed by the bacteria when grown in plasma, could be activated by exogenous and endogenous streptokinase, a potent plasminogen activating protein that is secreted by group A streptococci, thereby providing the bacteria with a surface-associated enzyme that could act on fibrin films or other tissue barriers in the infected host. While only a subset of these bacteria bind plasminogen, almost all group A streptococcal strains bind fibrinogen. It is known that this property is coupled to members of the M protein family. We first identified the fibrinogen-binding region in the type M1 and M5 proteins and then generated an isogenic strain expressing an M5 protein lacking the fibrinogen-binding region. This strain had lost the ability to resist phagocytosis in human blood, a feature that is characteristic for group A streptococci. Furthermore, streptococcal mutants expressing versions of the fibrinogen non-binding M4 protein grafted with the fibrinogen-binding regions from M1 or M5 were generated. The manipulation converted these strains from phagocytosis sensitive to phagocytosis resistant, demonstrating the importance of the fibrinogen-binding capacity for bacterial survival. The ability to bind fibrinogen also gives the bacteria the ability to interact with platelets. Fibrinogen serves as a link between the bacteria and the platelet and the subsequent binding of antibodies directed against the bacteria to the FcgRIIa receptor can induce platelet activation and aggregation, a property that may contribute to acute complications in severe group A streptococcal infection.

Abstract (Swedish)

Popular Abstract in Swedish

Streptococcus pyogenes Människan är ständigt koloniserad av en mängd olika mikroorganismer. De flesta bakterier är ofarliga och en del av dem är faktiskt nödvändiga för oss, t.ex. de tarmbakterier som hjälper oss att producera vitaminer. Grupp A streptokocker (GAS) eller Streptococcus pyogenes, är en av de vanligaste sjukdomsframkallande bakterierna hos människan. De kan orsaka en mängd olika infektioner, allt från okomplicerade sjukdomar som t.ex halsfluss (tonsillit), svinkoppor (impetigo) och scharlakansfeber (scarlatina) till livshotande djupa hudinfektioner (necrotiserande faciit). De kan också ge upphov till autoimmunologiskt betingade följdsjukdomar som t.ex. inflammation i hjärtklaffarna (reumatisk feber) och njurarna (glomerulonephrit). Dessa sjukdomar är ingen infektion i sig utan en sjukdom där människans eget immunsystem angriper kroppsegna vävnader. Vad det gäller reumatisk feber tros detta bero på att det finns ytstrukturer på bakterierna som liknar proteiner i hjärtvävnaden. I Sverige är dessa sjukdomar relativt ovanliga men i U-länder där den socio-ekonomiska standarden och tillgången till antibiotika är låg är dessa sjukdomar fortfarande en vanlig dödsorsak hos framförallt barn. För att kunna infektera sin värd producerar bakterierna en mängd olika faktorer som är skadliga för värden, såsom toxiner och vävnadsnedbrytande enzymer, vilka skulle kunna hjälpa bakterien att etablera sig. GAS uttrycker också så kallade M proteiner på sin yta. M proteinerna skyddar bakterierna mot att ”ätas upp” (fagocyteras) av värdens vita blodkroppar. Mekanismen bakom denna förmåga är dock inte helt klarlagd. M proteinerna har också visat sig ha förmågan att binda till flera mänskliga proteiner. Det har spekulerats i att bakterierna kan använda dessa interaktioner för att underlätta etablering av infektioner eller som skydd mot värdens försvarssystem. Detta skulle kunna ske på många olika sätt t.ex. genom att binda proteiner som kan nedreglera immunförsvaret eller att helt enkelt använda värdens proteiner som en förklädnad för att ”lura” värdens försvar.



Koagulation och fibrinolys Vid en skada på ett blodkärl exponeras proteiner som normalt inte finns i blodomloppet. Detta aktiverar blodkoagulationssystemet så att en blodpropp (tromb) kan bildas varvid blodflödet stoppas. När kärlet läker behövs inte tromben mer utan bryts ner av det fibrinolytiska systemet. Dessa system är normalt inte aktiva utan undertrycks av en mängd aktivatorer och hämmare som samverkar för att upprätthålla en ”lagom” nivå mellan koagulation och fibrinolys. Koagulationen kan delas upp i två delar som samarbetar med varandra och där proteinet fibrinogen har en central roll. I ett första steg aktiveras de s.k. blodplättarna (trombocyterna) av proteiner som exponeras vid en kärlskada. Aktiveringen leder till att fibrinogen binder samman trombocyterna till aggregat vilket tillfälligt stoppar blödningen. I ett andra steg verkar koagulationssystemet som är en kaskad av proteiner som aktiveras. Detta leder slutligen till att fibrinogen som cirkulerar i plasman klyvs och ändrar form och omvandlas till olösligt fibrin som bildar ett nätverk. Det fibrinolytiska systemets uppgift är att lösa upp blodproppar som inte längre behövs. Plasminogen är ett inaktivt förstadie till plasmin som är det aktiva enzymet i det fibrinolytiska systemet. Under normala förhållanden finns inget cirkulerande plasmin i blodet. Detta styrs av flertalet inaktivatorer som dels hämmar aktiveringen av plasminogen och dessutom plasminet själv. När en blodpropp ska brytas ner binder plasminogen till aminosyror av typen lysin som exponeras i ändarna av fibrinet. Plasminogen har speciella s.k. ”lysin bindnings site” (LBS) som ansvarar för denna bindning. Bundet plasminogen ändrar form och blir extra mottagligt för aktivering av de två humana aktivatorerna tPA och uPA. Plasminet klipper sedan sönder fibrinnätverket och proppen löses upp. Plasmin har en bred aktivitet och bryter inte bara ner ner fibrin utan även vissa vävnads proteiner som fibronectin och laminin. Denna förmåga att ”luckra upp” omgivningen tros vara viktigt vid processer där celler behöver förflytta sig till en annan plats i vävnaden t.ex. vid olika inflammationsprocesser eller vid sårläknng. Det har också visats att plasmin har viss betydelse för cancercellers förflyttning vid metastasbildning då man har sett att mängden aktivatorer av det fibrionlytiska systemet ökar. Det ligger i bakteriers intresse att kunna sprida sig genom vävnader och att kunna utnyttja det fibrinolytiska systemet hos sin värd skulle kunna vara till hjälp. Bakteriers interaktioner med koagulations- och fibrinolytiska systemet Flera olika bakteriearter har visat sig kunna interagera med proteiner i såväl koagulations- som fibrinolys systemet. För Yersinia pestis, den bakterie som orsakar pest, har denna interaktion visat sig vara av stor betydelse. Y. pestis producerar ett protein som kan aktivera plasminogen. Vid injektion av bakterier i huden hade genmanipulerade bakterier som saknade plasminogenaktivatorn kraftigt minskad förmåga att orsaka sjukdom. Om man däremot sprutade in bakterierna i blodet såg man inte denna minskning vilket kan tyda på att plasmin är viktigt för spridning just ut i vävnader från injektionsstället. Ett annat exempel är Borrelia burgdorferi, den bakterie som orsakar borrelios och som sprids med fästingar. Dessa bakterier kan binda plasminogen och man har kunnat visa att bakterier som har bundit plasminogen sprider sig lättare från platsen av fästingbettet ut i vävnaderna.



Pågående studier Det har sedan länge varit känt att grupp A streptokocker utsöndrar en plasminogen aktivator som kallas streptokinase. Man har sedan länge använt streptokinase vid behandling av hjärtinfarkt då man vill aktivera det fibrinolytiska systemet så att de blodproppar i hjärtats kranskärl som förorsakat infarkten löses upp. Vi har identifierat en grupp av GAS som binder till plasminogen och som företrädesvis orsakar hudinfektioner. I tidigare studier från vår forskar grupp har man visat att plasminogen-bindningen hos en av dessa stammar kunde knytas till ett ytexponerat protein tillhörande den s.k. M protein familjen som vi döpt till PAM. Andra medlemmar av denna familj av ytproteiner är sedan tidigare kända för att bidra till streptokockernas sjukdomsframkallande förmåga. I det första av delarbetena (se appendix, paper I) i denna avhandling har vi analyserat bindningen mellan plasminogen och PAM. Vi har identifierat den plasminogenbindande regionen i PAM och visat att lysiner är anvariga samt att de binder till de ”lysin bindnings site” i plasminogen som också är involverade i bindningen till fibrin och till vissa inaktivatorer. I delarbete II visar vi att grupp A streptokocker som odlas i närvaro av plasma kan binda plasminogen via PAM. Det bundna plasminogenet aktiveras därefter till plasmin med hjälp av streptokinas som utsöndras av streptokockerna. Denna mekanism, i likhet med vad som visats gälla för andra bakterier, skulle kunna vara en fördel för bakterien vid spridning vid en hudinfektion. För att fastställa den biologiska betydelsen av detta krävs dock ytterligare experiment. Sådana studier försvåras av att grupp A streptokocker enbart smittar människor och att det visat sig vara svårt att hitta en relevant djurmodell. De flesta grupp A streptokocker kan binda fibrinogen. Fibrinogen är inte bara viktigt för koagulationen utan anses också spela en roll för inflammationsprocesser, t.ex. vid transport av vissa vita blodkroppar (fagocyter) ut i vävnaderna genom blodkärlsväggen (endotelceller). Fibrinogen kan då medverka till att binda samman de två celltyperna genom att binda receptorer på de olika cellytorna (b2 integriner på fagocyter och ICAM-1 på endotelet). b2 integrinet på fagocyterna är också en central igenkännings-molekyl i själva fagocytosprocessen då bakterierna ”äts upp”. Denna receptor känner nämligen igen markörer (komplementfaktorer) med vilka immunförsvaret märker ut de bakterier som ska fagocyteras. Man har sedan länge trott att streptokockernas förmåga att binda fibrinogen är viktig för förmågan att undgå att fagocyteras. Att så är fallet har dock inte bevisats och någon exakt mekanism har inte kunnat presenteras. I arbete III undersöker vi ett 60-tal stammar och visar att i princip alla kan binda fibrinogen via sina M proteiner. Vi valde ut två stammar, M1 och M5, och visar till vilken del av streptokockernas M protein fibrinogenbindningen är lokaliserad (till de s.k. B domänerna). Vidare visar vi att man genom att avlägsna B-domänerna från M5 proteinet reducerar förmågan för straptokocker att motså fagocytos hos sådana streptokocker som uttrycker detta modifierade protein. Vi kan också visa att man genom att flytta B domänerna från ett fibrinogenbindande protein till ett icke-bindande och låta streptokockerna uttrycka dessa olika varianter kan öka bakteriernas motståndskraft mot kroppens försvar. Vid allvarliga streptokockinfektioner i huden (necrotiserande fasciit) kan man se en uttalad blodproppsbildning i kärlen i och kring infektionsstället. Detta kan ge effekter på behandlingen genom att det blir svårare för antibiotika att nå ut i den infekterade vävnaden och svårare för kroppens försvarsceller att ta sig fram. Ett liknande resonemang kan appliceras på vissa infektioner utlösta av vissa andra bakterier som t.ex. stafylokocker, som är en bakterie som kan etablera sig i blodflödet och förorsaka infektion på hjärtklaffarna (endokardit), där man ofta ser fibrin och bakretieutfällningar i kärlen. Mekanismen bakom proppbildning och fibrinutfällningar vid infektioner är inte klarlagd. En hypotes är att detta är ett sätt för kroppen att avgränsa den infekterade ytan men det kan också tänkas att det är något som bakterierna själva orsakar. I arbete IV har vi använt oss av ett system där man kan studera interaktioner mellan olika komponenter i blod (celler och proteiner) och molekyler och/eller celler på en yta under flöde. Processerna iakttas i ett mikroskop som kopplats till en videoutrustning. När vi placerade bakterier på botten av vårt artificella ”blodkärl” och kopplade på ett blodflöde kunde vi se att blodplättarna (trombocyterna) fastnade på bakterierna och aggregerade och så småningom gav upphov till blodproppsbildning. Den första bindningen mellan bakterien och trombocyten är medierad av fibrinogen som binder både streptokockernas M proteiner och en integrinreceptor, αIIbβ3, på trombocyten. Den andra – och starkare signalen till blodplättarna visades utgöras av antikroppar: Vi noterade en variation i förmågan att bilda blodproppar hos olika blodgivare och fann att bakteriens förmåga att orsaka blodproppar kunde korreleras till hur mycket antikroppar mot bakterierna som fanns i givarnas blod. Blod från donatorer med höga antikroppstitrar mot streptokocker gav upphov till mycket blodproppar. Dessa antikroppar bildar en brygga mellan bakterieytan och en receptor på trombocyterna (en s.k Fc receptor) som binder till ”svansen” på antikropparna. Detta gör trombocyten aktiveras och aggregerar så att en blodpropp bildas. Antikropparna fungerar som markörer i immunförsvaret och höga nivåer hjälper normalt till att döda bakterier. I detta fall verkar det snarare som om höga nivåer av antikroppar skulle kunna förvärra sjukdomsprocessen.



Sammantaget visar denna avhandling hur Streptococcus pyogenes kan interagera med människans system för koagulation och fibrinolys och genom dessa interaktioner främja bakteriernas förmåga att överleva i den infekterade värden. Att bakterier som sprids i vävnader uttnyttjar det fibrinolytiska systemet har visats för andra bakterier som Yersinia pestis och Borrelia burgdorferi. Vi har visat att även streptokocker kan interagera med detta system. Vilken betydelse detta har i spridningen av just dessa bakterier återstår att undersöka. Vi har också påvisat en mekanism där bakterierna kan inducera bildningen av blodproppar. Denna förmåga påverkas av patientens immunförsvar mot bakterien där ett bättre försvar orsakar mer proppbildning.

• author: Ringdahl, Ulrika
• supervisor: [unknown] [unknown]
• opponent: Bergström, Sven
• organization: Department of Immunotechnology
• publishing date: 2002
• type: Thesis
• publication status: published
• subject: Immunology in the medical area; Microbiology in the medical area
• keywords: Infections, mykologi, virologi, bakteriologi, M protein, Streptococcus pyogenes, plasminogen, fibrinogen, phagocytosis, platelet, Microbiology, bacteriology, virology, Mikrobiologi, mycology, Infektioner, Immunology, serology, transplantation, Immunologi, serologi
• pages: 112 pages
• defense location: Fernströmssalen, BMC, Sölveg 19, Lund
• defense date: 2002-06-07 10:15:00
• ISBN: 91-628-5207-8
• language: English
• LU publication?: yes
• additional info: Article: I Carlsson Wistedt A, Ringdahl U, Müller-Esterl W, Sjöbring U. (1995) Identification of a plasminogen-binding motif in PAM, a bacterial surface protein. Molecular Microbiology 18:569-578 Article: II Ringdahl U, Svensson M, Carlsson Wistedt A, Renné T, Keller R, Müller-Esterl W, and Sjöbring U. (1998) Molecular co-operation between protein PAM and streptokinase for plasmin acquisition by Streptococcus pyogenes. Journal of Biological Chemistry 273:6424-6430 Article: III Ringdahl U, Svensson H, Kotarsky H, Gustafsson M, Weineisen M, and Sjöbring U. (2000) A role for the fibrinogen-binding regions of streptococcal M proteins in phagocytosis resistance. Molecular Microbiology 37(6):1318-1326 Article: IV Sjöbring U, Ringdahl U, and Ruggeri ZM. (2002) Induction of platelet thrombi by bacteria and antibodies. Submitted.
• id: ab43f0b5-2b88-417f-9c4d-f0682f999f08 (old id 464671)
• date added to LUP: 2016-04-04 10:15:29
• date last changed: 2018-11-21 20:57:43