Mechanisms of transendothelial and tissue transport in the peritoneum. Experimental studies on rat

Abstract

In the present thesis, the quantitative role of active transport (transcytosis) in bulk transvascular protein movement in vivo was evaluated. Using chemical transcytosis inhibition (N-ethylmaleimide (NEM) and filipin), we were able to show that NEM actually increases endothelial permeability to macromolecules, probably as a result of unspecific toxic action on endothelial cells. Filipin, on the other hand had no effects on transperitoneal protein permeability in vivo. Our permeability effects of NEM have been confirmed in perfused rat lungs, in isolated perfused rat hindquarters and, on a morphological level, in rat aorta. Thus, the array of papers providing morphological evidence for a decreased protein transport after NEM and filipin administration in situ and in vitro should be handled with great caution. We therefore turned to a more physiologic way of inhibiting active transport, namely by in vivo cooling. We found that protein transport in hypothermic rats did not cease, as could be expected if transcytosis were the main route of transport, but was reduced in proportion to the reduced blood pressure and to the cooling-induced increases in viscosity. The largest molecule tested, low-density lipoprotein (LDL), was slightly more cooling-sensitive than the other macromolecules, however. This result is probably reflecting the presence of inflammatory gaps at 37°C, that were absent in the cold animals (19°C). The opening of such gaps has previously been shown to be an active, calcium-dependent process that can be inhibited by cooling. Another transport issue treated in this thesis was the impact of the interstitium on transperitoneal transport. Addition of hyaluronan (HA), a major component of the interstitial ground substance, to the dialysis fluid resulted in an improved net ultrafiltration. This finding was shown to be due to the formation of a HA-filter cake, in the late phase of the dwell, when net fluid movement is directed towards tissue capillaries, thus reducing the fluid back-filtration. The present thesis further evaluates a highly controversial transport issue, i.e. whether or to what extent small solute transport is blood flow limited in the peritoneum. We thus induced blood flow reductions by way of bleeding rats. We found a significantly lower small solute transport when blood flow was reduced, but the reduction was much lower than what has been found in other organs. The reason for this is probably that the peritoneal interstitium imposes a transport resistance, which conceals the high level of blood flow limitation occurring at the capillary level.

Abstract (Swedish)

Popular Abstract in Swedish

Njurarnas huvudsakliga funktion i kroppen är att rena blodet från slaggprodukter och reglera vätskebalansen. Hos patienter med nedsatt njurfunktion måste blodet renas på alternativa sätt. Antingen leds blodet ut via slangar till en maskin som renar blodet (hemodialys), eller används bukdialys, så kallad peritoneal dialys (PD). Vid PD häller patienten dialysvätska i bukhålan via en slang genom bukväggen. Dialysvätskan innehåller en hög koncentration av socker. Om man har två lösningar med olika koncentrationer som separeras av en barriär, strävar naturen efter att utjämna koncentrationsskillnaderna. Denna process kallas diffusion och gör att framförallt små molekyler transporteras från den höga koncentrationen till den låga, tills lika koncentrationer har uppnåtts. Om membranet är semipermeabelt, dvs inte släpper igenom alla molekylstorlekar, uppstår ett annat fenomen, osmos. Osmos gör att vatten transporteras mellan lösningarna tills lika koncentrationer uppnåtts. Vid transport mellan blod och dialysvätska finns det tre huvudsakliga barriärer som måste passeras. Den första är väggen i de minsta blodkärlen, kapillärerna. Transporten över kapillärväggen sker genom tre olika porer. Den minsta, vattenkanalen, är bara genomsläpplig för vatten. De små porerna släpper igenom vatten och små molekyler, och de stora porerna släpper igenom molekyler ända upp till proteinstorlek. Nästa barriär är bindväven som omger kapillärerna. Det råder delade meningar om huruvida denna barriär är viktig vid transport. Bindväven är en relativt lucker vävnad som består av olika fiberlika molekyler samt en del celler. Eftersom bindvävnaden är ganska lucker torde den inte ge ett så stort motstånd mot transport jämfört med kapillärväggen. Detta gäller speciellt stora molekyler, vilka möter stort motstånd när de ska passera kapillärväggen. Den tredje barriären som måste passeras är ett lager av celler som täcker bukhinnan, det så kallade mesotelet. Mellan mesotelcellerna är det ganska öppet, så förmodligen kan de flesta molekyler passera fritt. Detta har visats i flera studier. I delarbete II och IV studeras hur stora molekyler transporteras över kapillärväggen. Två uppfattningar finns om hur detta sker, och ämnet debatteras fortfarande. Den ena uppfattningen är att stora molekyler transporteras aktivt i små blåsor som cellerna bildar (så kallade vesikler). Vesiklerna förflyttas sedan över till andra sidan cellen, där de tömmer sitt innehåll. Processen kallas transcytos. Den andra uppfattningen är att stora molekyler transporteras passivt genom de stora porerna, och att det är trycket i kapillärerna som gör att molekylerna filtreras genom porerna. För att studera den relativa rollen av transcytos i proteintransport försökte vi i delarbete II hämma transcytos. Vi använde oss av två kemikalier, N-ethylmaleimide (NEM) och filipin. Ett flertal tidigare studier har visat att vid administration av NEM och filipin till organ eller celler, minskar transporten av protein. Detta resultat tolkades som att protein transporterades med hjälp av transcytos. Vi fann däremot, när vi gav NEM till råttor, att transporten istället ökade. Detta beror på att NEM ökar permeabiliteten i kapillärerna genom att skada kärlväggarna. När vi gav filipin förändrades inte proteintransporten alls. Våra resultat gällande NEM stämmer överens med tidigare studier i olika organ, och även i enstaka blodkärl. Därför kan vi dra slutsatsen att NEM och filipin inte är användbara för att hämma transcytos i hela organ eller hela djur. Man bör därför behandla de tidigare NEM och filipinarbetena med skepsis. Eftersom det inte går att inhibera transcytos med kemikalier, använde vi oss av en annan metod i delarbete IV. Genom att kyla ner djur eller organ, inhiberas alla aktiva processer, eftersom de är beroende av temperatur. Tidigare studier med nedkylning har visat att proteintransport bara minskar i förhållande till den ökade viskositeten (”trögflytandegraden”) som en temperaturminskning inducerar. Sålunda kylde vi ner hela råttor från 37°C till 19°C och mätte transporten av olika stora molekyler. Under nedkylning av hela djur, måste man ta med i beräkningarna att blodtrycket faller kraftigt, och även blodflödet. I en kall råtta kan man förvänta sig att transcytos, som är väldigt kylkänslig, i princip är noll. Å andra sidan, om proteintransport sker via stora porer, kan man förvänta sig att transporten minskar i förhållande till den ökade viskositeten och det minskade blodtrycket i kapillärerena. På grund av dessa två faktorer bör portransporten minska till ca 25% efter nedkylning. De uppmätta transporthastigheterna var dock inte noll utan proteintransporten minskade till ca 20-30% jämfört med varma djur. Därför kan vi dra slutsatsen att proteintransport inte sker via transcytos, utan den stämmer väl överens med portransport. Den allra största molekylen vi testade avvek dock lite från de övrigas mönster och var lite mer kylkänslig. Detta beror förmodligen på att de varma djuren har en mild inflammation, som gör att några få inflammatoriska kanaler (jättestora porer) är öppna. Vid nedkylning stängs dessa kanaler, eller är mycket färre i antal. Det har tidigare visats i organstudier att sådana kanaler är kylkänsliga. I delarbete I studerade vi hur bindväven påverkar transportmönstret vid dialys. En viktig komponent i bindväven är hyaluronsyra (HA). Tidigare försök där HA har tagits bort genom att använda ett enzym, visade att transportmönstret av olika molekyler och vatten inte påverkades nämnbart. I andra studier har man istället tillsatt HA till dialysvätskan. Man fann då att vätsketransporten från bukhålan tillbaka till blodet minskade. Detta förklarades med att HA bygger upp en ”filterkaka” på bukhinnan, som gör att vattentransporten minskar genom en generell sänkning av membranets förmåga att släppa igenom vatten. Vi gjorde liknande försök i delarbete I, och fann även vi att vätsketransporten tillbaka till blodet minskade. Vi kunde dock visa att förklaringen till observationen som tidigare angetts inte stämde. Istället kunde vi visa att filterkakan inte ger en generell sänkning av membranets genomsläpplighet för vatten, utan att den bildas först i slutet av en dialysperiod, när vätska transporteras tillbaka till blodet. Då minskar kakan återflödet av vätska. Transporten av små molekyler påverkades inte nämnvärt av filterkakan. I delarbete III studerade vi en annan kontroversiell aspekt om transportprocesser, nämligen huruvida små molekylers transport påverkas av blodflödet. Man kan på teoretisk grund förvänta sig att små molekyler, som med lätthet kan transporteras med diffusion, påverkas av blodflödet. Enkelt uttryckt kan man se det som att ifall blodflödet ökar levereras fler molekyler som snabbt kan transporteras över kärlväggen. Tidigare studier är kontrasterande i sina resultat. Vi minskade blodflödet i råttor i delarbete III genom att dra ut ca 25% av den totala blodmängden. Blodflödet mättes i bukväggen, samtidigt som vi mätte transporten av små molekyler. Vi fann att små molekyler faktiskt är begränsade av blodflödet i bukhålan. Kvantiteten på blodflödesberoendet visade sig dock vara mycket mindre än vad man har uppmätt i andra organ. Därför verkar det som om bindväven påverkar den småmolekylära transporten så att den höga nivån av blodflödeslimitation som finns på kapillär nivå döljs. Sammanfattningsvis kan vi dra slutsatsen att proteintransport över kapillärväggen troligtvis sker genom stora porer. Detta har tidigare visats i studier på olika organ. Nyligen utvecklades dessutom en musmodell, där mössen genom genetisk modifiering saknade en komponent som behövs för transcytos. Dessa möss verkar dock normala, och har normala koncentrationer av proteiner i vävnader och blod. Därför verkar det inte som om transcytosprocessen har någon större betydelse för proteintransport. Vi utvecklar själva en musmodell för PD, och hoppas att vi ska kunna få genmodifierade möss som vi kan mäta proteintransport i. Vidare kan man genom att lägga till HA förbättra vätskeutbytet vid PD. Huruvida detta har någon klinisk betydelse återstår att se. Liknande resultat som våra har nyligen erhållits i patienter, men för att få statistisk signifikans på resultaten i den studien behövs större grupper. Som i övriga vävnader är småmolekylär transport i bukhålan beroende av blodflödet, men nivån är lägre. Detta innebär att man faktiskt kan genomföra PD på patienter som uppvisar chocktillstånd. Det totala utbytet av vätska och små molekyler är nämligen fortfarande gott, kanske till och med förhöjt vid låga blodflöden.

• author: Rosengren, Bert-Inge
• supervisor: [unknown] [unknown]
• opponent: Professor Haraldsson, Börje, Department of Nephrology, Sahlgrenska University Hospital, Göteborg
• organization: Nephrology
• publishing date: 2003
• type: Thesis
• publication status: published
• subject: Urology and Nephrology
• keywords: nefrologi, Urologi, hyaluronan, interstitium, blood flow, rat, pore, inhibition, temperature, peritoneal dialysis, permeability, capillary, protein, passive, active, transport, transcytosis, vesicle, Urology, nephrology, small solute
• pages: 102 pages
• defense location: Segerfalksalen, Wallenberg Neurocentrum, BMC A, Lund
• defense date: 2003-06-14 10:15:00
• ISBN: 91-628-5723-1
• language: English
• LU publication?: yes
• additional info: Article: Rosengren BI, Carlsson O, and Rippe B. Hyaluronan and peritoneal ultrafiltration: A test of the filter cake hypothesis. Am J Kidney Dis 2001;37:1277-1285 Article: Rosengren BI, Al Rayyes O, and Rippe B. Transendothelial transport of low-density lipoprotein and albumin across the rat peritoneum in vivo. Effects of the transcytosis inhibitors NEM and filipin. J Vasc Res 2002;39:230-237 Article: Rosengren BI and Rippe B. Blood flow limitation of small solute transfer during peritoneal dialysis in rats. J Am Soc Nephrol 2003;14(6):1599-1604 Article: Rosengren BI, Carlsson O, Venturoli D, Al Rayyes O, and Rippe B. Transvascular passage of macromolecules in normo- and hypothermic rats in vivo. Active or passive transport? Manuscript
• id: 8484bf96-29fe-4f57-a288-6d07b9e553b4 (old id 465902)
• date added to LUP: 2016-04-04 11:51:59
• date last changed: 2018-11-21 21:07:42