The Balance between Pro- and Antiinflammatory Molecules in ANCA-Associated Vasculitis

Abstract

ANCA-associated systemic vasculitis (AASV) is a group of inflammatory disorders, characterized by inflammation and necrosis of blood vessels and frequently granuloma formation. Patients with AASV make autoantibodies, so called ANCA, against proteins present in the granules of neutrophils and monocytes, mainly proteinase 3 (PR3) and myeloperoxidase (MPO). Clinically, disease progression is characterized by a relapsing-remitting course. Although remitting in nature, disease flares can lead to permanent organ damage or even death. Moreover, the standard therapy of today, high-dose corticosteroids and cyclophospahamide, is associated with severe side effects like bladder cancer and severe infections and although effective in inducing remission, the relapse rates are high.



The pathogenesis is still unknown and the importance of ANCA debated. In this thesis some fundamental aspects, like gene expression of the ANCA antigens and status of immune activation have been addressed. The main findings are those of a PR3-expression in circulating monocytes, 9-fold higher in our patients than in the controls, together with deranged circulating cytokine pattern. Most interestingly, these findings are present in patients who are in complete clinical remission, indicating some kind of basic defect in the immune system. A disability to resolve inflammatory processes would eventually lead to self-perpetuating grumbling activity, held back by local protease inhibitors like SLPI and inhibitory cytokines like IL-10. This would create a borderline environment, making it easy for some sort of unknown trigger, such as a virus or another environmental factor, to elicit a full blown inflammatory response. ANCA could, if present, probably fuel this process by interacting with antigens expressed on the surface of neutrophils and monocytes.



Besides the pathogenic aspects, some of the results might have clinical implications. IL-6 seems to be a potential marker of imminent relapse and should be thoroughly evaluated as such in a larger patient study over a longer time period. IL-8, on the other hand, might be a prognostic marker, considering the strong association with impending organ damage. The finding of low IL-10 levels being associated with relapse tendency of course evokes interest in exploring its therapeutic potential.

Abstract (Swedish)

Popular Abstract in Swedish

Kroppens immunförsvar är en kraftfull organisation som styrs av ett intrikat samspel mellan olika molekyler. Dess främsta uppgift är att försvara kroppen mot främmande ämnen, såsom virus och bakterier. Detta kräver en snabb reaktion, vilken naturen löst i form av ett kaskadsystem, där ett första fåtal molekyler inom loppet av minuter aktiverat miljontals molekyler och celler. Normalt hålls immunförsvaret i schack av ett otal interna kontrollsystem. Trots dessa kontrollsystem finns det ett antal sjukdomar där den inflammatoriska processen på något sätt spårat ur och där inflammation uppstår utan något syfte. I vissa fall kan t o m immunförsvaret reagera på kroppsegna ämnen, s. k. autoimmuna reaktioner. Exempel på autoimmuna sjukdomar är ledgångsreumatism och diabetes typ 1 (ungdomsdiabetes).



Ordet ‘vaskulit’ betyder kärlinflammation. Med ‘systemisk vaskulit’ menas inflammation i blodkärl på flera olika ställen i kroppen. S.k. ANCA-associerade systemiska vaskuliter (AASV) drabbar ff. a små kärl i luftvägarna och i njurarna. De drabbade organen kan få permanenta skador och då njurarna är drabbade löper patienterna i slutändan risk att behöva dialys. AASV drabbar ca . och obehandlade leder de ofta till döden inom loppet av veckor. Den behandling som finns idag är mycket aggressiv och behäftad med svåra biverkningar, såsom ett kraftigt försvagat immunförsvar och en ökad cancerrisk. Patienterna bildar s k ANCA, vilket står för anti-neutrofila cytoplasmatiska autoantikroppar. Detta är antikroppar riktade mot proteiner som finns inuti vita blodkroppar. Antikropparna känner alltså igen kroppsegna proteiner och är därför s.k. autoantikroppar. När ANCA upptäcktes i slutet av 80-talet (?)låg det nära till hands att anta att de här antikropparna var sjukdomsalstrande och att AASV var autoimmuna sjukdomar. Sjukdomsaktiveten går i skov och kan under flera år hålla sig borta. Halten ANCA i blodet varierar med sjukdomsaktiviteten och stiger inför ett nytt skov. Man har på olika sätt försökt visa att ANCA ger systemisk vaskulit, men hitintills är bevisen inte övertygande. Dessutom vet man inte varför ANCA bildas.



ANCA är som nämnts ovan riktade mot proteiner som finns inuti vita blodkroppar. Det är ff a två proteiner det handlar om, proteinas 3 (PR3) och myeloperoxidas (MPO). Både PR3 och MPO är enzymer, d v s proteiner med kapacitet att bryta ner eller omvandla andra proteiner. PR3 har dessutom en rad andra egenskaper som påverkar immunförsvaret. Enzymers aktivitet kan blockeras av s. k. hämmare, d v s en annan typ av proteiner som kan binda till enzymer och därigenom hindra dem från att utöva sina aktiviteter. I blodet blockeras PR3 som utsöndrats från vita blodkroppar av hämmaren a1-antitrypsin,. Vår forskningsgrupp har i tidigare studier kunnat visa att patienter med AASV i större utsträckning än andra lider brist på just a1-antitrypsin och således har en ökad mängd obundet PR3 i blodet. Vi har även visat att patienter med a1-antitrypsinbrist har sämre prognos.



Ett annat protein som kan hämma olika enzymer är Sekretorisk leukocyt-proteinase inhibitor, SLPI. SLPI är en mer lokalt verkande hämmare än a1-antitrypsin, dvs den blockerar enzymer ute i olika organ snarare än i blodet. SLPI produceras av celler i en rad olika organ, men det har inte tidigare undersökts om SLPI produceras i njurarna.



Med tanke på att patienter med AASV ofta utvecklar njurskador, till följd av inflammation med frisättning av olika nedbrytande enzymer, studerade jag i mitt första arbete (I) förekomsten av SLPI i njurvävnad. I bitar av frisk njurvävnad från patienter där man opererat bort en njure pga cancer kunde jag påvisa såväl färdigt SLPI som dess förlaga, SLPI mRNA. Hypotesen var i det här skedet att en brist på SLPI, analogt med bristen på a1-antitrypsin, kunde föreligga hos patienterna. Nästa arbete (II) handlade således om SLPI vid AASV. I blod från patienter mätte jag halten SLPI, vilken snarast låg högre än hos friska kontrollpersoner. Jag studerade också förekomsten av SLPI i nässlemhinna från ett antal patienter och jämförde med ett friskt kontrollmaterial. Inte heller här kunde jag finna någon tendens till SLPI-brist hos patienterna, snarare tvärtom. Via samarbete med en forskningsgrupp i USA fick jag tillgång till data om produktionen av SLPI i vita blodkroppar från patienter. En ökad produktion av SLPI kunde ses och den korrelerade med sjukdomsaktiviteten. Sammanfattningsvis motbevisades den ursprungliga hypotesen och istället kunde en ökad SLPI-produktion påvisas, troligen som en del av patienternas allmänna inflammatoriska tillstånd.



PR3 är som nämnts ovan ett av de proteiner patienterna bildar autoantikroppar mot. En brist på dess hämmare a1-antitrypsin har tidigare påvisats, men ingen har på något systematiskt sätt studerat mängden PR3 i blodet hos patienter med AASV. En ökad PR3-mängd i blodet, skulle innebära ökad exponering och därmed en ökad risk för bildning av autoantikroppar. Denna hypotes studerade jag i mitt tredje arbete (III). Halten PR3 mättes i blod från ett 60-tal patienter. Jämfört med friska kontrollpersoner befanns PR3 i blodet ligga signifikant högre hos patienterna. Detta berodde inte på en allmän inflammatorisk process, då korrelation mellan PR3 och olika inflammationsmarkörer ej kunde påvisas. Inte heller en allmän retning av vita blodkroppar föreföll ligga bakom, då andra proteiner från vita blodkroppar inte var förhöjda. Med anledning av det här fyndet ville jag gå vidare med att försöka identifiera källan till den förhöjda mängden PR3 vid AASV.



I arbete IV isolerade jag en viss typ av vita blodkroppar, s. k. monocyter, från blodprov tagna från dels ett knappt 20-tal av våra patienter, dels från friska kontroller. Från monocyterna renade jag fram RNA, d v s steget mellan gener och färdiga proteiner, för att kunna studera PR3-produktionen i den här celltypen. Produktionen visade sig vara ca 10 ggr högre hos patienterna än hos kontrollerna. En tendens till positiv korrelation mellan PR3 på RNA-nivå och PR3 fritt i blodet kunde noteras. Jag använde patienter med SLE (en annan inflammatorisk sjukdom) som ytterligare kontroller och även de låg signifikant lägre i PR3-produktion än våra patienter. Detta är ett intressant fynd, speciellt som jag inte heller här kunde se något tydligt samband mellan graden av inflammation och mängden PR3. Istället förefaller patienterna ha någon form av grundläggande avvikelse i sitt immunförsvar. För att utreda detta vidare genomfördes den femte studien, under vilken jag tittade på olika molekyler som deltar på olika sätt i immunförsvaret.



Cellerna i kroppens immunförsvar kommunicerar med varandra via bl. a en grupp molekyler som kallas cytokiner. Dessa cytokiner har olika egenskaper, vissa stimulerar immunförsvaret, medan andrabromsar. En del av substanserna är s. k. kemotaktiska, vilket innebär att de lockar till sig olika typer av vita blodkroppar. I arbete V har jag samlat blodprov från ett knappt 100-tal patienter, för analys av cytokinerna IL-6 (stimulerande), IL-8 (kemotaktisk), IL-10 (bromsande) och MCP-1 (kemotaktisk). Från ca en femtedel av patienterna har jag även renat fram vita blodkroppar och studerat deras genuttryck av IL-6, IL-8 och IL-10. Resultaten visade förhöjda halter av IL-6, IL-8 och IL-10 hos alla patienter, oavsett hur aktiv deras sjukdom var vid provtagningstillfället. Även patienter i lugnt skede, utan någon uppenbar sjukdomsaktivitet, hade förhöjda cytokinnivåer jämfört med friska kontroller. Patienter med pågående sjukdomsskov hade ytterligare högre nivåer av IL-6, medan IL-8 och IL-10 inte skiljde sig så mycket. I prover tagna från patienter som var i ett lugnt skede, men som inom kort utvecklade ett sjukdomsskov, fann jag lägre nivåer av IL-10 än hos patienter som inte utvecklade något skov inom tre månader från provtagningen. Detta indikerar en skyddande effekt av IL-10, som ju har kapacitet att bromsa immunförsvaret. IL-6 visade istället en tendens att stiga inför sjukdomsskov och skulle därför ev. kunna ha ett visst förutsägande värde. Patienter med dålig prognos, med avseende på permanenta organskador och bestående men, tenderade att ligga högre i IL-8 än patienter med bättre prognos. IL-8 skulle alltså eventuellt kunna säga något om patienternas prognos.

• author: Ohlsson, Sophie
• supervisor: [unknown] [unknown]
• opponent: Professor Savage, Caroline, Birmingham University, UK
• organization: Nephrology
• publishing date: 2003
• type: Thesis
• publication status: published
• subject: Urology and Nephrology
• keywords: nephrology, Urologi, nefrologi, Urology, monocyte, SLPI, proteinase 3, ANCA, vasculitis, inflammation
• pages: 128 pages
• defense location: Segerfalksalen, Wallenberg neurocentrum, Sölvegatan 17, Lund
• defense date: 2003-12-05 09:15:00
• ISBN: 91-628-5897-1
• language: English
• LU publication?: yes
• additional info: Article: I. Ohlsson S, Ljungkrantz I, Ohlsson K, Segelmark M, Wieslander J (2001) Novel distribution of the secretory leukocyte proteinase inhibitor in kidney. Mediat Inflamm 10, 347-350. Article: II. Ohlsson S, Falk R, Yang JJ, Ohlsson K, Segelmark M, Wieslander J (2003) Increased expression of the secretory leukocyte proteinase inhibitor in Wegener’s granulomatosis. Clin Exp Immunol 131, 190-196. Article: III. Ohlsson S, Wieslander J, Segelmark M (2003) Increased circulating levels of proteinase 3 in patients with anti-neutrophilic cytoplasmic autoantibodies-associated systemic vasculitis in remission. Clin Exp Immunol 131, 528-535. Article: IV. Ohlsson S, Hellmark T, Pieters K, Sturfelt G, Wieslander J, Segelmark M. Increased monocyte transcription of the proteinase 3 gene – cause or consequence of ANCA-associated systemic vasculitis? (Submitted) Article: V. Ohlsson S, Wieslander J, Segelmark M. Circulating cytokine profile in ANCA-associated vasculitis – prediction of outcome? (Submitted)
• id: 8113dd65-aec0-45a2-9f82-90d824d7c8bc (old id 466347)
• date added to LUP: 2016-04-04 12:15:13
• date last changed: 2018-11-21 21:09:54