Molecular Characterization of Genomic Amplifications in Pancreatic Cancer

Abstract

Pancreatic cancer includes multiple histologic subtypes that show large differences in their clinical and biological characteristics. Despite this diversity, more than 85% of the neoplasms in the organ are malignant ductal adenocarcinomas, which are the focus of the present thesis. At the genetic level this tumor type is characterized by highly rearranged karyotypes, resulting in a large number of DNA copy number alterations. As these are believed to play a major role in pancreatic tumorigenesis, the aim of the present thesis was to molecularly characterize such imbalances, particularly genomic amplifications, in a panel of 32 pancreatic carcinoma cell lines. The first study was based on previously generated CGH data, which indicated frequent local amplifications of 12p11-12. For precise characterization of this region, we used single-copy FISH analysis and PCR-based STS mapping. This delineated a commonly amplified segment of 3.5 Mb in six cases. To identify potential target genes in this region, a chromosome segment-specific cDNA array containing 29 genes/ESTs, were used to search for consistently overexpressed genes. This analysis identified four genes/ESTs, including <i>PPFIBP1</i> and <i>DEC2</i>. In the second study we performed array-based CGH for high-resolution mapping of genome-wide DNA copy number alterations. For this purpose, two separate microarray platforms were used, the first containing >3,500 BAC clones and the second encompassing >25,000 cDNA clones. In total, 60 amplifications at 32 different genomic loci were characterized in detail. The most frequently amplified regions were located in 8q23-24 and 12p11-12. Apart from the large number of genomic amplifications, the array-based CGH analyses identified several homozygously deleted segments, including sequences within 9p24, 9p21, 9q32, 10p12, 10q22, 12q24, and 18q23. In the third study we performed expression profiling to investigate the transcriptional consequences of the genomic alterations identified by the array-based CGH analyses. This investigation showed a strong correlation between DNA copy numbers and gene expression levels in pancreatic cancer. Moreover, the expression analysis revealed that the most commonly amplified regions do not appear to have a single target gene. Instead, the results suggested that several target genes may be of importance in each amplified segment, and that these may show varying degrees of overexpression in individual amplifications. Nevertheless, the expression profiling study identified new genes in both the 8q23-24, and the 12p11-12, amplicons of potential importance for the development of pancreatic cancer.

Abstract (Swedish)

Popular Abstract in Swedish

Pankreascancer (cancer i bukspottkörteln) drabbar årligen mer än 200 000 personer över hela världen, varav omkring 900 i Sverige. Sjukdomen är starkt associerad till ökad ålder och drabbar följaktligen väldigt sällan personer under 40 år, medan risken att drabbas vid 80 års ålder är 40 gånger förhöjd. På grund av dess mycket aggressiva tillväxt, tidiga metastasering samt ospecifika symptom är sjukdomsprognosen mycket nedslående. Medianöverlevnaden är ca 6 månader och 5-årsöverlevnaden mindre än 3%. Kurativt syftande behandling, genom kirurgiskt ingrepp och efterföljande kemo- samt strålningsterapi, är endast aktuellt för den minoritet patienter (ca 15%) som besitter lokalt angränsade tumörer, men även hos dessa är prognosen dålig (5-årsöverlevnad ca 20%).



Även om de exakta orsakerna inte är kända tros sjukdomen, liksom många andra tumörsjukdomar, vara en följd av en ansamling nedärvda eller förvärvade mutationer i cancerrelaterade gener. Förutom ökad ålder är tobaksrökning den enda väletablerade riskfaktorn och den ökar risken för sjukdom 2-5 gånger beroende på rökvanor samt antal år under exponering. Cancerrelaterade gener delas huvudsakligen in i onkogener, vilka befrämjar celldelning, samt in i tumörsuppressorgener, vilka hämmar celldelning. Genom förändringar i dessa (aktivering av onkogener samt inaktivering av tumörsuppressorgener) kan tumörceller etablera okontrollerade celldelningar, vilka gradvis kan leda till cancer. Ett relativt vanligt sätt att aktivera onkogener i många tumörtyper är genom genamplifiering, d.v.s. en selektiv förökning av antalet kopior av en given DNA-sekvens. Denna mekanism leder vanligtvis till att en eller ett flertal av de påverkade generna uppvisar förhöjt uttryck, vilket i specifika onkogeners fall kan leda till en cancerassocierad effekt. Syftet med studierna i den aktuella avhandlingen var att molekylärt kartlägga samt utreda effekten av vanligt förekommande genamplifieringar i pankreascancer. Då stora metodologiska landvinningar gjorts samtidigt som kartläggningen av den mänskiga arvsmassan (genomet) fullbordats, har möjligheterna till effektiv detaljanalys av genkopior över hela genomet avsevärt förbättrats de senaste åren. Eftersom dessa framsteg vid tidpunkten ännu inte fått genomslag, valde vi i den första studien att inrikta oss på amplifieringar inom 12p (den korta armen av kromosom 12), vilka indikerats vara vanligt förekommande i tillgängliga CGH-data (grova uppskattningar av genkopietal över hela genomet). Studien inriktades framför allt på sex tumörfall, vilka samtliga antydde lokalt begränsade 12p-amplifieringar. Med hjälp av teknikerna FISH (”fluorescence <i>in situ</i> hybridization”) och PCR (”polymerase chain reaction”), vilka båda ger hög upplösning och därmed detaljerad information, lyckades vi identifiera en gemensamt amplifierad region på 3.5 Mb (~3% av kromosom 12) i samtliga sex fall. För att kunna bestämma potentiella överuttryckta målgener (onkogener) i denna region producerade vi ett ”array”-filter för effektiv expressionsanalys av 29 gener i den aktuella regionen. Denna analys lyckades urskilja fyra potentiella målgener, varav <i>PPFIBP1</i> visade ett markant överuttryck i samtliga fall.



I den andra studien utförde vi, med ovan nämnda teknik- och sekvenseringsframsteg, en detaljerad helgenomsanalys av kopietalsförändringar i 31 olika pankreastumörcellinjer. För detta ändamål använde vi oss av ”microarray”-baserad teknik vilken möjliggjorde högupplösningsanalys av kopietal över hela genomet i individuella experiment. Dels bekräftade denna analys större, tidigare kända kopietalsavvikelser, dels identifierades ett stort antal amplifieringar och homozygota deletioner (förlust av båda genkopiorna). Totalt bestämdes de exakta molekylära gränserna för 60 amplifieringar vid 32 olika positioner i genomet. Då en stor andel av de amplifierade regionerna (amplikonen) var mindre än den lägre detektionsgränsen för CGH (~2 Mb), som tidigare varit standardmetoden för helgenomskartläggning av amplifieringar, visade denna studie dessutom att förekomst av amplifieringar i pankreascancer är större än vad man tidigare har antagit. De vanligast involverade regionerna återfanns inom 8q (den långa armen av kromosom 8) och 12p, men även avsnitt inom 6p, 6q, 7q, 8p, 17q, 18q, 19q, och 20q var återkommande amplifierade. Förutom amplifieringsfynden uppvisade sju olika regioner inom 9p24, 9p21, 9q32, 10p12, 10q22, 12q24 och 18q23 homozygota förluster. Åtminstone en av dessa, 9q32, var associerad med förlust av en potentiell tumörsuppressorgen, <i>DEC1</i>.



För att utreda konsekvenserna av de identifierade kopietalsförändringarna, använde vi oss i den sista studien av samma ”microarray”-system som tidigare, fast denna gång applicerat på mRNA-nivå (expression) istället för DNA-nivå (genkopietal). Genom att kombinera resultat från de båda studierna kunde det konstateras att antalet genkopior starkt präglar expressionsnivån i pankreascancer. Detta var speciellt uttalat i kraftigt amplifierade segment, där upp till 60% av generna visade associerat överuttryck. Genom en systematisk analys av de tidigare identifierade genamplifieringarna urskildes följaktligen ett mycket stort antal överuttryckta gener; 492 gener i 55 amplikon. Närmare analys av de mest återkommande amplifieringarna visade emellertid att de överuttryckta generna i dessa inte alltid var desamma. Detta tyder på att ett flertal gener inom varje amplikon kan ha betydelse för tumörutveckling och att dessa kan visa olika aktiveringsmönster i individuella fall med amplifiering av samma kromosomsegment. Sammanfattningsvis visar studierna att genamplifieringar i pankreascancer är relativt vanliga men samtidigt mycket heterogena, vilket gör identifieringen av specifika målgener mycket komplicerad.

• author: Heidenblad, Markus
• supervisor: [unknown] [unknown]
• opponent: Professor Isola, Jorma, University of Tampere, Tampere, Finland
• organization: Division of Clinical Genetics
• publishing date: 2004
• type: Thesis
• publication status: published
• subject: Medical Genetics
• keywords: FISH, Clinical genetics, PCR, cDNA microarray, array-based CGH, expression profiling, genomic profiling, Pancreatic cancer, gene amplification, Klinisk genetik
• pages: 90 pages
• defense location: May 19, 2004, 10 am, Lund University Hospital, Lecture room F2
• defense date: 2004-05-19 10:00:00
• ISBN: 91-628-6043-7
• language: English
• LU publication?: yes
• additional info: Article: Heidenblad M, Jonson T, Mahlamäki EH, Gorunova L, Karhu R, Johansson B, and Höglund M. (2002) Detailed genomic mapping and expression analyses of 12p amplifications in pancreatic carcinomas reveal a 3.5-Mb target region for amplification. Genes Chromosomes Cancer 34:211-223.Heidenblad M, Schoenmakers EFPM, Jonson T, Gorunova L, Veltman JA, Geurts van Kessel A, and Höglund M. (2004) Array-based comparatove genomic hybridization reveals multiple targets of genomic amplifications and novel homozygous deletions in pancreatic carcinoma cell lines. Cancer Res (in press)Heidenblad M, Lindgren D, Veltman JA, Jonson T, Mahlamäki EH, Gorunova L, Geurts van Kessel A, Schoenmakers EFPM, and Höglund M. (2004) Microarray analyses reveal strong influence of DNA copy number alterations on the transcriptional patterns in pancreatic cancer. (manuscript)
• id: e9245924-7e14-462e-b24a-e0d07199ecef (old id 466904)
• date added to LUP: 2016-04-04 11:37:37
• date last changed: 2018-11-21 21:06:05