Advanced

Vitreoscilla Haemoglobin. Genetic Fusions and Metabolic Characterisation

Roos, Viktoria LU (2004)
Abstract (Swedish)
Popular Abstract in Swedish

Genteknik innebär stora möjligheter att förändra och förbättra organismers egenskaper. Genom att i en organism föra in en främmande gen kan man ge den helt nya egenskaper som den aldrig skulle ha förvärvat på naturlig väg. Genmodifierade bakterier odlas idag industriellt i stora bioreaktorer för tillverkning av olika proteiner, till exempel insulin till diabetiker, humant tillväxthormon och tvättmedelsenzymer.



Ett problem när man odlar bakterier i stora bioreaktorer är att bibehålla en jämn och hög syrenivå. Det är svårt att få tillräcklig omrörning och syretillförsel i reaktorn, vilket lätt leder till att det uppstår syrebrist. Syrebristen gör att celltillväxten och... (More)
Popular Abstract in Swedish

Genteknik innebär stora möjligheter att förändra och förbättra organismers egenskaper. Genom att i en organism föra in en främmande gen kan man ge den helt nya egenskaper som den aldrig skulle ha förvärvat på naturlig väg. Genmodifierade bakterier odlas idag industriellt i stora bioreaktorer för tillverkning av olika proteiner, till exempel insulin till diabetiker, humant tillväxthormon och tvättmedelsenzymer.



Ett problem när man odlar bakterier i stora bioreaktorer är att bibehålla en jämn och hög syrenivå. Det är svårt att få tillräcklig omrörning och syretillförsel i reaktorn, vilket lätt leder till att det uppstår syrebrist. Syrebristen gör att celltillväxten och proteinproduktionen avtar, istället börjar bakterierna tillverka biprodukter som etanol, ättiksyra och mjölksyra. Detta är naturligtvis ett problem då man ute i industrin strävar efter att så snabbt som möjligt uppnå höga koncentrationer av det önskade proteinet.



Ett sätt att hjälpa bakterierna att överleva och må bra i syrefattiga miljöer är att ge dem möjlighet att binda in mer syre. Detta kan uppnås genom att i bakterien föra in en gen för något syrebindande protein, exempelvis ett hemoglobin. I min forskning har jag arbetat med ett bakteriellt hemoglobin från en bakterie som heter Vitreoscilla. Detta hemoglobin (VHb) har visat sig förbättra syrebegränsad tillväxt hos andra organismer, bland annat olika bakterier och växter. Jag har arbetat med att försöka få fram ett bättre hemoglobin än det naturliga genom att på olika gentekniska vägar modifiera VHb. I mitt arbete har jag på genteknisk väg skapat ett dubbel-VHb (dubbel-hemoglobin) genom att sätta ihop två gener av VHb till ett enda protein (bilden på framsidan visar två dubbel-VHb-molekyler). Detta dubbel-VHb har visat sig signifikant bättre än det naturliga hemoglobinet. Odlingar med E. coli-bakterier som innehåller detta dubbel-hemoglobin ger upp till 30 % mer bakterier än odlingar med bakterier utan VHb. Detta dubbel-hemoglobin har jag sedan arbetat vidare med i flera olika projekt, bland annat har jag använt så kallad microarray-teknik (DNA-chips) för att kunna få reda på vad som händer inne i bakterien (studera de metaboliska förloppen) och för att undersöka skillnaderna mellan bakterier som innehåller dubbel-VHb och de som innehåller vanligt VHb.



I ett annat projekt med VHb har jag satt på slumpvisa svansar (små proteindelar bestående av sex aminosyror) på hemoglobinet för att studera vilka effekter de olika aminosyrorna har på proteinets egenskaper. Denna studie gav upphov till flera hemoglobinvarianter, vilka uppvisade stora skillnader i egenskaper (se Figur 4, s 15). En del av dessa var åtskilligt mycket bättre än det ursprungliga oförändrade hemoglobinet utan svans. Ett antal nya intressanta samband kunde också avslöjas mellan de nya egenskaperna hos hemoglobinvarianterna och vilka sorts aminosyror svansen innehöll. Jag kunde till exempel se att vissa aminosyror (de med positiv eller negativ laddning) ledde till att mycket mer VHb bildades, medan andra aminosyror (de långa utan laddning) minskade produktionen av VHb. (Less)
Abstract
Vitreoscilla is an obligate aerobic bacterium living in oxygen-poor environments such as stagnant ponds and decaying vegetable matter. Vitreoscilla expresses a homodimeric haemoglobin (VHb) when subjected to oxygen-limited conditions. In several organisms, expression of VHb has been shown to increase microaerobic cell growth and enhance oxygen-dependent cell metabolism. Moreover, the presence of VHb has been shown to enhance recombinant protein synthesis, as demonstrated by both total protein content and the activity of expressed enzymes. It has been hypothesised that VHb may facilitate oxygen transport and/or storage. Furthermore, it has been shown that VHb interacts specifically with subunit I of the cytochrome o complex from... (More)
Vitreoscilla is an obligate aerobic bacterium living in oxygen-poor environments such as stagnant ponds and decaying vegetable matter. Vitreoscilla expresses a homodimeric haemoglobin (VHb) when subjected to oxygen-limited conditions. In several organisms, expression of VHb has been shown to increase microaerobic cell growth and enhance oxygen-dependent cell metabolism. Moreover, the presence of VHb has been shown to enhance recombinant protein synthesis, as demonstrated by both total protein content and the activity of expressed enzymes. It has been hypothesised that VHb may facilitate oxygen transport and/or storage. Furthermore, it has been shown that VHb interacts specifically with subunit I of the cytochrome o complex from Vitreoscilla and Escherichia coli, thereby suggesting that VHb provides oxygen directly to the terminal oxidase.



This thesis describes the results of two different fusion approaches that were applied to VHb in order to improve and elucidate its properties. In the first approach, short random polypeptide tags were added to the N-terminus of VHb. The results clearly demonstrated the large impact a small N-terminal polypeptide extension can have on the properties of a protein; the library of randomly hexapeptide-tagged VHb displayed a wide variety of properties, e.g. a broad range of expression levels, cell colours and VHb activities. Furthermore, the results indicate the importance of mRNA secondary structure predictions when optimising expression levels of recombinant proteins.



In the second approach, a VHb-VHb fusion protein was created (termed double VHb) which displayed enhanced growth properties when expressed in E. coli compared with those of native VHb. Higher final cell densities were obtained under all cultivation conditions tested, i.e. growth under low and high aeration conditions as well as growth in high-salinity media. Furthermore, enhanced levels of ribosomes and tRNA were observed in cells expressing double VHb. DNA chip analysis revealed mRNA levels that indicated an increased TCA cycle, respiration and ATP synthesis rate of double-VHb-expressing cells. (Less)
Please use this url to cite or link to this publication:
author
opponent
  • Prof. Archer, David, School of Life and Environmental Sciences, University of Nottingham, United Kingdom.
organization
publishing date
type
Thesis
publication status
published
subject
keywords
Biochemistry, Metabolism, Biokemi, metabolism, osmotic stress, transcript profiling, DNA microarrays, random elongation mutagenesis, directed evolution, mRNA structure, Vitreoscilla haemoglobin (VHb), Escherichia coli, salt stress.
pages
126 pages
publisher
Viktoria Roos, Pure & Applied Biochemistry, Lund University
defense location
Lecture Hall B, Center for Chemistry and Chemical Engineering, Lund Institute of Technology.
defense date
2004-06-16 13:15
ISBN
91-628-6122-0
language
English
LU publication?
yes
id
cd0bab84-3971-479a-a832-94add221db5e (old id 467149)
date added to LUP
2007-10-13 15:03:13
date last changed
2016-09-19 08:45:14
@phdthesis{cd0bab84-3971-479a-a832-94add221db5e,
  abstract     = {Vitreoscilla is an obligate aerobic bacterium living in oxygen-poor environments such as stagnant ponds and decaying vegetable matter. Vitreoscilla expresses a homodimeric haemoglobin (VHb) when subjected to oxygen-limited conditions. In several organisms, expression of VHb has been shown to increase microaerobic cell growth and enhance oxygen-dependent cell metabolism. Moreover, the presence of VHb has been shown to enhance recombinant protein synthesis, as demonstrated by both total protein content and the activity of expressed enzymes. It has been hypothesised that VHb may facilitate oxygen transport and/or storage. Furthermore, it has been shown that VHb interacts specifically with subunit I of the cytochrome o complex from Vitreoscilla and Escherichia coli, thereby suggesting that VHb provides oxygen directly to the terminal oxidase.<br/><br>
<br/><br>
This thesis describes the results of two different fusion approaches that were applied to VHb in order to improve and elucidate its properties. In the first approach, short random polypeptide tags were added to the N-terminus of VHb. The results clearly demonstrated the large impact a small N-terminal polypeptide extension can have on the properties of a protein; the library of randomly hexapeptide-tagged VHb displayed a wide variety of properties, e.g. a broad range of expression levels, cell colours and VHb activities. Furthermore, the results indicate the importance of mRNA secondary structure predictions when optimising expression levels of recombinant proteins.<br/><br>
<br/><br>
In the second approach, a VHb-VHb fusion protein was created (termed double VHb) which displayed enhanced growth properties when expressed in E. coli compared with those of native VHb. Higher final cell densities were obtained under all cultivation conditions tested, i.e. growth under low and high aeration conditions as well as growth in high-salinity media. Furthermore, enhanced levels of ribosomes and tRNA were observed in cells expressing double VHb. DNA chip analysis revealed mRNA levels that indicated an increased TCA cycle, respiration and ATP synthesis rate of double-VHb-expressing cells.},
  author       = {Roos, Viktoria},
  isbn         = {91-628-6122-0},
  keyword      = {Biochemistry,Metabolism,Biokemi,metabolism,osmotic stress,transcript profiling,DNA microarrays,random elongation mutagenesis,directed evolution,mRNA structure,Vitreoscilla haemoglobin (VHb),Escherichia coli,salt stress.},
  language     = {eng},
  pages        = {126},
  publisher    = {Viktoria Roos, Pure & Applied Biochemistry, Lund University},
  school       = {Lund University},
  title        = {Vitreoscilla Haemoglobin. Genetic Fusions and Metabolic Characterisation},
  year         = {2004},
}