Phosphatidylethanol - formation and degradation in blood and organs.

Abstract

Phosphatidylethanol (PEth) is an abnormal phospholipid formed exclusively by the action of phospholipase D (PLD) in the presence of ethanol. The degradation of PEth is slow and due to its accumulation in some cells the possibility to use PEth as marker of ethanol intake has been proposed. It has also been suggested that PEth mediates some of the damaging effects of ethanol on cells. This study was made to investigate the formation and degradation of PEth, after ethanol exposure, in organs, blood, and cell-lines from animals and humans both in vivo and in vitro. After different in vivo alcohol exposures, the level of PEth accumulated in organs of rats was measured. Blood from humans, rats, a pig and a ferret was also incubated in vitro with ethanol for investigation of the PEth formation. The degradation of PEth was studied in human blood and in two cell-lines in vitro. PEth content in organs and blood from cadavers of alcoholics was measured. The effect of storage conditions on PEth content in blood and organs was studied. PEth was measured in blood from two groups of alcoholic patients and related to the ethanol intake and to three clinically available markers of chronic ethanol intake. PEth was analysed by high performance liquid chromatography (HPLC) and evaporative light scattering detection. The analytical method for PEth was improved by using internal standard, and by modifying the extraction method the limit of quantification could be lowered. Rats exposed to ethanol acutely or chronically formed PEth in most of their organs. The amount of PEth formed in the organs varied, and it was shown that both the differences in type of exposition, and ethanol concentrations, are of importance. Also the rate of PEth degradation varied among the organs. No in vivo PEth formation occurred in the rat blood. PEth was formed in human blood incubated in vitro with ethanol. However, in blood from rat, pig, and ferret, no PEth formation occurred in vitro. PEth formation in human blood in vitro was linear with time and ethanol concentration dependant; individual variation in formation rate was demonstrated. No degradation of PEth could be observed in human blood during 48 hours in vitro. Very high PEth concentrations were found in organs and blood from the autopsied alcoholics, probably due to formation of PEth during freezing at –20°C. Storage of rat organs and human blood at –20°C with ethanol present highly elevates PEth levels. Rat organs and human blood without ethanol present can be frozen at –20°C without affecting PEth levels. In blood from alcoholics PEth had a diagnostic sensitivity of 100% in inpatients and 98% in outpatients. The sensitivity of the other markers varied between 28% and 77%. PEth, CDT, and GGT correlated to ethanol intake with the strongest correlation found for PEth. Thus PEth is highly correlated to ethanol intake and the present results indicate that the diagnostic sensitivity is higher than in previously established alcohol markers.

Abstract (Swedish)

Popular Abstract in Swedish

Arbetet med denna avhandling har handlat om en abnormal fosfolipid (fettämne) som bildas i kroppens celler endast när alkohol är närvarande, lipiden kallas fosfatidyletanol (PEth). För att lättare kunna förstå resultaten av våra undersökningar börjar jag med en kort bakgrund. Alla kroppens celler är omgärdade av ett membran som skiljer dem från varandra och omgivningen. Cellmembranet är till stor del uppbyggt av fosfolipider. Enzymer är proteiner, som underlättar kemiska reaktioner. Det finns flera enzymer som kallas fosfolipaser som förändrar fosfolipider i membranet genom en kemisk reaktion till nya molekyler. De nybildade molekylerna kan fungera som budbärare inne i cellen och på så vis påverka cellens funktion. Fosfolipaserna hjälper till att föra signaler från cellytan vidare in i cellen och de deltar också i cellens basala funktioner. Alkoholmolekylen är både vatten- och fettlöslig. Denna egenskap gör att när alkohol intas kan den passera cellmembranet och fördelas i vatten- och fettmiljöer i cellen där den påverkar funktioner både i membranet och inuti cellen. En av fosfolipaserna, fosfolipas D (PLD), bildar normalt fosfatidsyra från vatten och fosfatidylkolin (en av de allra vanligaste fosfolipiderna i membranet). PLD föredrar alkohol framför vatten, och i närvaro av alkohol bildar PLD den abnormala lipiden PEth i stället för fosfatidsyra, som är en viktig budbärare i cellen. PEth är långlivad och ansamlas i membranet där den har annorlunda egenskaper än de normalt förekommande lipiderna och därför påverkas membranets fysikaliska egenskaper. Det har spekulerats att PEth tillsammans med alkohol och andra molekyler som bildas när alkoholen tas om hand i kroppen kan orsaka de organskador som förekommer i samband med hög alkoholkonsumtion. Det är därför av intresse att ta reda på i vilka organ PEth bildas vid alkoholintag, och hur mycket, för att försöka att klargöra sambandet med organskada. PEth kan även mätas i blod hos människor som har intagit stora mängder alkohol under en viss period och kan därmed tänkas vara en bra biokemisk markör för alkoholmissbruk. Alkoholmissbruk är ett av de stora folkhälsoproblemen. Av den vuxna befolkningen i Sverige räknar man med att 10% av den manliga och 4-5% av den kvinnliga befolkningen är alkoholmissbrukare/alkoholberoende. En tidig upptäckt av sådana tillstånd och förebyggande åtgärder skulle kunna hindra mycket lidande både hos patienten själv och hos anhöriga, som ofta även de är hårt drabbade av patientens sjukdom. Biokemiska alkoholmarkörer är ämnen som går att mäta i utandningsluft och/eller kroppsvätskor (blod, urin) efter intag av alkohol. De vanligast använda markörerna för att upptäcka långvarigt alkoholmissbruk är glutamyltransferas (GGT), kolhydratfattigt-transferrin (CDT) och medelcellvolymen hos röda blodkroppar (MCV). Dessa markörer kan visa positivt svar även för andra sjukdomar än alkoholism (falska positiva) och de kan också ge negativt svar trots stort alkoholintag (falska negativa). Ingen av dessa markörer som nämnts här har tillräckligt hög sensitivitet (förmåga att hitta de som har sjukdomen, dvs. dricker mycket) och specificitet (förmåga att utesluta de som inte har sjukdomen, dvs. ”normala” konsumenter) för att kunna användas som screeningmetod för alkoholmissbruk. Forskning pågår för att få fram nya alkoholmarkörer som är mer tillförlitliga, dvs. har högre specificitet och högre sensitivitet.



Våra undersökningar har klargjort hur mycket PEth som bildas i blod och organ hos råttor vid olika typer av alkoholexponering. Alkoholen har getts till djuren som injektioner i buken, som vattenlösning med olika alkoholstyrka och som flytande fullvärdig kost med alkohol tillsatt. Blod från människor, råttor, gris och iller har fått alkohol tillsatt i laboratoriet för att se om PEth bildas i blodet under kontrollerade förhållanden. Humant blod och odlade cell-linjer har använts för att studera försvinnandet av PEth. Halten PEth i blod och organ från avlidna alkoholister har mätts. Hur olika förvaringsbetingelser påverkar PEth-halten i blod och organ har undersökts. PEth, GGT, CDT och MCV har mätts hos alkoholister för att jämföra PEth som markör med de etablerade markörerna. Markörernas förhållande till alkoholintaget de sista fjorton dagarna studerades också.



Råttor som får alkohol antingen akut, med injektion, eller kroniskt, i dricksvatten eller flytande diet, ansamlar PEth i mätbara mängder i de flesta organ. En injektion är tillräcklig. Genom att titta på PEth-mängden i organen vid olika tidpunkter (2, 4 och 8 timmar) efter injektionen kunde försvinnandehastigheten i de olika organen uppskattas. Efter kroniskt alkoholintag varierade mängden ansamlad PEth i organen beroende på sättet som alkoholen gavs, i vatten eller i flytande kost, och också på alkoholstyrkan i vätskan. Förvånansvärt nog fanns det inte mätbara mängder PEth i blodet trots att de kroniskt alkoholbehandlade råttorna hade PEth i sina organ. Humant blod som får stå tillsammans med alkohol i provrör bildar PEth. Mängden som ansamlas ökar med tiden och också med alkoholstyrkan. I blod från råtta, gris och iller som fått stå på samma sätt ansamlades inget PEth, vilket indikerar att människan är speciell i avseendet att ansamla PEth i sitt blod. Detta medför att råttan som djurmodell inte fungerar för att undersöka förhållandet mellan hur mycket PEth som bildas i blodet jämfört med organen. Det hade varit av intresse att kunna uppskatta hur mycket PEth som finns i organen när en viss PEth-halt mäts i blodet, om det hade fungerat, då det kanske kan förutspå risk för organskador. Genom att låta humant blod stå tillsammans med alkohol kunde det konstateras att ansamlingen av PEth i människoblod är långsammare än i råttorgan, och försök att mäta hur fort PEth bryts ner i blodet visade att ingen nedbrytning sker under 48 timmar. Detta tyder på att enzym för att bryta ner PEth saknas i blodet. Trots att PEth bildas långsamt så medför frånvaron av nedbrytning att PEth ansamlas i blodet i sådan omfattning att det blir mätbart efter viss tids konsumtion av alkohol. För att försöka klargöra vilka enzym som är aktiva vid nedbrytningen av PEth användes två olika cell-linjer, den ena liknar nervceller och den andra leverceller. I bägge cell-linjerna bröts PEth ner och försvann helt på ca 4 timmar. Genom att använda hämmare av olika enzymer kunde nedbrytningen minskas i olika grad. Detta visar att minst två olika enzym är involverade och att de är olika aktiva i olika celler. Detta kan förklara den variation i nedbrytningshastighet som observerats i råttorganen. PEth mättes i blod och organ från avlidna alkoholister, vilka alla var alkoholpåverkade när döden inträffade. Proven var frysta vid 20°. De uppmätta PEth-värdena var mycket högre än förväntat, baserat på resultaten från råttförsöken. Detta föranledde en undersökning av hanteringsproceduren för proven. Efter studier på råttorgan och humant blod, kunde det fastslås att frysning vid 20°C av blod och organ som innehåller alkohol stimulerar PEth-bildning med följden att falskt för höga PEth-värden uppstår. Sådana prover bör frysas i flytande kväve och förvaras vid 80°C. Om däremot ingen alkohol är närvarande när provet tas går det bra att frysa det vid 20°C eftersom PEth-halten då inte påverkas. Slutsatsen av modellförsöken är att de uppmätta PEth-värdena hos de avlidna alkoholisterna med all sannolikhet var falskt för höga. Av större intresse är att resultaten för alkoholisterna klart visar att människor har en hög kapacitet att bilda PEth i sina organ.



Mätningar i blod från alkoholister visade att PEth fanns i 96 av 97 analyserade blodprover. Den diagnostiska sensitiviteten var mycket högre än för CDT, GGT och MCV, andra etablerade markörer. Resultaten visar att PEth är starkare kopplat till hur mycket alkohol som har druckits de senaste fjorton dagarna än vad de andra markörerna är. Alla patienter som medverkade i studien var diagnostiserade alkoholister, så någon utvärdering av specificiteten (andel falska positiva) för PEth kunde inte göras. Eftersom PEth endast kan bildas i närvaro av alkohol och den analytiska metoden har god specificitet och precision för PEth mätning finns all anledning att anta att den diagnostiska specificiteten är hög. Framtida studier i den vanliga befolkningen får utvisa om detta stämmer.

• author: Aradottir, Steina
• supervisor: [unknown] [unknown]
• opponent: Professor Theodorsson, Elvar, Linköping University
• organization: Breastcancer-genetics
• publishing date: 2004
• type: Thesis
• publication status: published
• subject: Neurology
• keywords: Diagnostik, Public health, Diagnostics, organs, blood, HPLC, in vitro, in vivo, human, rat, phosphatidylethanol, phospholipase D, alcohol, ethanol, epidemiology, Folkhälsa, epidemiologi
• pages: 100 pages
• defense location: Segerfalkssalen, Wallenberg Neurocentrum, Sölvegatan 33, Lund
• defense date: 2004-10-08 09:00:00
• ISBN: 91-28-6234-0
• language: English
• LU publication?: yes
• additional info: Article: I. Aradottir, S., Lundqvist, C. and Alling, C. Phosphatidylethanol in rat organs after ethanol exposure. Alcohol Clin Exp Res 26:514-8, 2002. Article: II. Aradottir, S., Moller, K. and Alling, C.: Phosphatidylethanol formation and degradation in human and rat blood. Alcohol Alcohol 39:8-13, 2004. Article: III. Aradottir, S., Seidl, S., Wurst, FM., Jönsson, BAG. and Alling C. Phosphatidylethanol in human organs and blood; a study on autopsy material and influences by storage conditions. In press. Alcohol Clin Exp Res. Article: IV. Aradottir, S., Asanovska, G., Gjerss, S., Hansson, P. and Alling C. Phosphatidylethanol (PEth) concentrations in blood are correlated to alcohol intake in alcohol dependent patients. Manuscript The information about affiliations in this record was updated in December 2015. The record was previously connected to the following departments: Medical Neurochemistry (ceased) (LUR000012), Oncology, MV (013035000)
• id: b5c785dd-8931-480d-9586-06bae7df6ccb (old id 467298)
• date added to LUP: 2016-04-04 11:11:33
• date last changed: 2018-11-21 21:03:14