The Role of Phosphodiesterase 3B in the Regulation of Insulin Secretion

Abstract

Pancreatic beta-cell dysfunction and insulin resistance are the two hallmarks of type 2 diabetes. An early sign of beta-cell dysfunction is impaired nutrient-induced insulin release. Several insulin secretagogues act by increasing the formation of intracellular cAMP. Thus, accurate regulation of cAMP is of vital importance for the ability of the beta-cell to respond properly to these stimuli. The level of cAMP is defined by the activities of adenylyl cyclases and cAMP-degrading phosphodiesterases (PDEs). The aim of this thesis was to study the role of PDE3B in the regulation of insulin secretory processes in pancreatic beta-cells and in the regulation of overall energy homeostasis. Results in this thesis demonstrate that mice with a specific increase in beta-cell PDE3B activity (RIP-PDE3B mice) have, in comparison to control mice, a reduced insulin response to glucose as well as to glucose in combination with GLP-1, glucose intolerance and altered islet morphology. Moreover, when metabolically challenged RIP-PDE3B mice develop severe obesity and insulin resistance. The insulin secretory capacity of isolated islets from RIP-PDE3B mice was studied and a specific reduction in the first phase of glucose-stimulated insulin release was identified. An important role of beta-cell PDE3B for exocytosis and release of insulin was further demonstrated by overexpression of PDE3B and by selective inhibition of the enzyme in both insulinoma cell lines and rat pancreatic islets. Of specific interest was the marked decrease of glucose-stimulated cAMP levels and concomitant decrease in insulin release observed in cells overexpressing PDE3B. In summary, this thesis has contributed to an increased understanding for the role of beta-cell PDE3B in the regulation of insulin secretory processes. Results suggest that PDE3B regulates cAMP pools important for exocytosis of insulin-containing granules responsible for the first phase of insulin release. Also, these studies bring forward the role of cAMP in nutrient-induced insulin release. Finally, the work in this thesis demonstrates for the first time a functional role for beta-cell PDE3B in the maintenance of whole body energy homeostasis in mice.

Abstract (Swedish)

Popular Abstract in Swedish

Denna avhandling är en s.k. sammanläggningsavhandling och innehåller tre delarbeten. Delarbete I är publicerat, delarbete II är under revision inför publikation och delarbete III är i manuskriptform. Syftet med mina studier har varit att undersöka regleringen av insulinsekretion från de insulinproducerande cellerna i bukspottkörteln med fokus på ett specifikt protein - fosfodiesteras 3B (PDE3B).



Bakgrund



Diabetes mellitus, i dagligt tal också kallad sockersjuka, är en globala folksjukdom och förekomsten av sjukdomen har ökat dramatiskt under senare år. Antalet diabetespatienter beräknades år 2001 vara drygt 150 miljoner och beräknas fördubblas till år 2025. Detta enligt siffror från den internationella diabetesfederationen (IDF). Diabetes är ett samlingsnamn på ett flertal sjukdomar som uppstår till följd av flera olika orsaker men som samtliga slutligen leder till förhöjda nivåer av socker (glukos) i blodet. Diabetes kan delas in i två huvudgrupper; typ 1 diabetes, också kallad insulinberoende diabetes eller ungdomsdiabetes, och typ 2 diabetes, också kallad icke insulinberoende diabetes eller åldersdiabetes. Typ 1 diabetes drabbar cirka 10% av diabetespatienterna och orsakas av brist på hormonet insulin. Insulin är det hormon som signalerar till kroppens vävnader att ta upp och lagra näringsämnen. Typ 1 diabetes uppstår till följd av att vårt eget immunförsvar bryter ner de insulinproducerande cellerna. Typ 2 diabetes drabbar cirka 90% av alla diabetespatienter. Antalet typ 2 diabetiker ökar snabbt i västvärlden, vilket har kopplats samman med ärftliga faktorer, fysisk inaktivitet och övervikt. Orsaken till typ 2 diabetes är inte känd, men symtomen är att utsöndringen av insulin minskar och att de vävnader, muskel, fettväv och lever, som normalt svarar på insulinsignalen blir okänsliga. Denna oförmåga att svara på insulin kallas insulinresistens. Insulin produceras i bukspottkörteln. Bukspottkörteln är belägen bakom magsäcken och består av två delar: en exokrin och en endokrin. Den exokrina delen producerar pankreassaft som innehåller enzymer vilka är viktiga för nedbrytningen av intagen föda till små beståndsdelar. Den endokrina delen består av små så kallade Langerhanska cellöar. Namnet kommer av dess upptäckare Paul Langerhans (1869). Dessa öar består av ansamlingar av olika typer av celler varav beta-cellerna är de som producerar insulin. Beta-cellerna är de enda cellerna i kroppen som kan producera och utsöndra insulin. Insulin utsöndras som svar på ökade nivåer av näringsämnen i kroppen, som till exempel efter en måltid. Insulin signalerar i sin tur till de insulinkänsliga målvävnaderna att ta upp och lagra glukos, fettsyror och aminosyror i form av kolhydrater, fett och protein. Det huvudsakliga stimulit för insulinutsöndring är glukos. Glukosmolekylen tas upp av beta-cellen där den bryts ner, vilket genererar energi i form av ATP. ATP binder till och stänger ATP-känsliga kaliumkanler i cellens cellmembran. Det minskade utflödet av kalium höjer membranpotentialen och leder till öppnandet av spänningskänsliga kalciumkanaler i cellmembranet. Detta leder till ökad koncentration av kalcium inne i cellen som i sin tur leder till insulinutsöndring. Denna glukosstimulerade insulinutsöndring påverkas av ett stort antal utifrån kommande signaler. Gemensamt för många av de signaler som kan öka den glukosstimulerade insulinutsöndringen är att de verkar via en ökning av cykliskt AMP (cAMP). cAMP är en så kallad ”second messenger” eller budbärare som för signalen vidare in i cellen och påverkar andra proteiners aktiviteter, vilket slutligen leder till en ökad glukosstimulerad insulinutsöndring. Detta kallas cAMP-potentierad glukossstimulerad insulinutsöndring. cAMP nivåerna i cellen regleras av de protein (enzym) som producerar respektive bryter ner cAMP. Enzymer som bryter ner cAMP kallas fosfodiesteraser (PDE). Det finns elva olika familjer av PDE:er och inom varje familj finns det flera subfamiljer. I min avhandling har jag studerat rollen av PDE3B i regleringen av insulinutsöndring från beta-cellerna.



Resultat



I delarbete I studerades uttrycket av PDE3 i odlade beta-celler och i isolerade cellöar från råtta. Vi kunde visa att i beta-celler är PDE3B det huvudsakliga enzymet av de två existerande PDE3 medlemmarna (PDE3A och PDE3B), och att PDE3B återfinns specifikt i membraner av beta-celler. Vidare undersöktes rollen av PDE3B i regleringen av glukosstimulerad och cAMP-potentierad insulinutsöndring. Dessa processer studerades i beta-celler och isolerade öar från råtta som manipulerats så att de hade en ökad mängd PDE3B. Vi kunde visa att en ökad mängd av PDE3B leder till minskad glukosstimulerad- och cAMP-potentierad insulinutsöndring i beta-celler och öar och har direkt hämmande effekter på den proccess som reglerar själva utsläppet av insulin (exocytos). Vi använde oss också av hämmare av PDE3 för att minska mängden aktivt PDE3 och kunde då visa att insulinutsöndringen istället ökade.



I delarbete II studerade vi rollen av beta-cell-PDE3B för reglering av energibalansen i möss som manipulerats så att de har ett ökad mängd av PDE3B endast i beta-cellerna (transgena möss). Intravenösa glukostoleranstester utfördes vilket innebär att sövda möss belastas med glukos och under cirka en timme tas flera blodprov för bestämning av insulin- och glukosnivåer i blodet. I arbete II visade vi att mängden insulin som svar på glukos var minskad i de transgena mössen, vilket var kopplat till en försämrad förmåga att sänka blodsockret. Öar isolerades från dessa möss och vi kunde visa att den minskade mängden insulin var kopplad till en minskad utsöndring av insulin som svar på glukos. Vidare visade vi att den stimulerande effekten av cAMP på glukosstimulerad insulinutsöndring också minskade i både mössen och i de isolerade öarna. Vi fann även att många öar från transgena mössen var större än normalt och att deras cellstruktur var förändrad.



I delarbete III studerade vi möss efter att de fått äta en kost rik på fett under en längre tid och så jämfördes transgena och normala kontroll möss. Det var känt sedan tidigare att kontrollmössen utvecklar fetma och insulinresistens som svar på fet kost. Våra transgena möss utvecklade fetma snabbare än kontrolldjuren trots att de inte åt mer än dessa. Vi kunde visa att de transgena mössen utsöndrade höga nivåer av insulin (hyperinsulinemi) men trots detta var glukosnivåerna ändå höga. Detta är ett tecken på att vävnader i kroppen utvecklat en lägre känslighet för insulin, det vill säga insulinresistens. Vi utförde ett så kallat intraperitonealt insulintoleranstest på mössen. Detta innebär att sövda möss ges en injektion av insulin i magen och blodprover tas under en timme för bestämningar av insulin- och glukosnivåer i blodet. Vi kunde visa att de transgena mössen var oförmögna att sänka glukosnivåerna trots insulininjektionen. Detta är en indikation på utveckling av insulinresistens. Vi studerade också öarnas storlek och struktur och fann att öarna från de transgena mössen efter fetkostbehandlingen nu var ännu större och förändringar av cellernas struktur var ännu tydligare än de vi tidigare sett i de transgena djuren på normal kost. Sammantaget tyder dessa resultat på att våra trangena möss med en ökad mängd PDE3B är mer benägna att utveckla fetma och insulinresistens än de normala mössen.



Slutsats



Det övergripande syftet med mina studier var att öka förståelsen för hur insulinutsöndring regleras. Detta är av betydelse för att förstå de defekter som ligger till grund för minskad utsöndring av insulin vid typ 2 diabetes och också för utvecklingen av nya läkemedel som specifikt kan öka utsöndringen av insulin. Slutsatsen av dessa studier är att mängden PDE3B är viktig för regleringen av de cAMP nivåer som påverkar insulinutsöndringen och därmed regleringen av energibalansen i kroppen. Mot bakgrunden av dessa resultat i möss vore utvecklingen av en hämmare mot PDE3B i beta-cellerna en strategi för utvecklandet av nya diabetesläkemedel.

• author: Härndahl, Linda
• supervisor: [unknown] [unknown]
• opponent: Professor Gylfe, Erik, Uppsala University, Sweden
• organization: Department of Experimental Medical Science
• publishing date: 2003
• type: Thesis
• publication status: published
• subject: Basic Medicine
• keywords: diabetology, Endokrinologi, sekretion, diabetologi, secreting systems, Endocrinology, beta-cell, diabetes, islet, PDE3B, cAMP
• pages: 103 pages
• defense location: GK Lecture Hall, BMC
• defense date: 2003-12-15 09:15:00
• ISBN: 91-628-5855-6
• language: English
• LU publication?: yes
• additional info: Article: I. Härndahl, L., Jing, XJ., Ivarsson, R., Degerman, E., Ahrén, B., Manganiello, V.C., Renström, E. and Stenson Holst, L. Important Role of Phosphodiesterase 3B for the Stimulatory Action of cAMP on Pancreatic Beta-Cell Exocytosis and Release of Insulin. J Biol Chem. 2002 Oct 4;277(40):37446-55 Article: II. Härndahl, L., Wierup, N., Enerbäck, S., Mulder, H., Manganiello, V.C., Sundler, F., Degerman, E., Ahrén, B. and Stenson Holst, L.Beta-Cell-Targeted Overexpression of Phosphodiesterase 3B in Mice Causes Impaired Insulin Secretion, Glucose Intolerance and Deranged Islet Morphology. Under revision for publication in J Biol Chem. Article: III. Härndahl, L., Wierup, N., Zmuda-Trzebiatowska, E., Manganiello, V.C., Sundler, F., Degerman, E., Ahrén, B. and Stenson Holst, L. Diet-Induced Diabetes in Mice Overexpressing Beta-Cell PDE3B is Associated with Early Developed Obesity, Severe Islet Dysfunction and Adipose Tissue Insulin Resistance. Manuscript
• id: 4efa5903-58f4-4866-8e0d-2553799d9f93 (old id 466359)
• date added to LUP: 2016-04-04 10:29:09
• date last changed: 2018-11-21 20:59:02