Microorganisms in the Indoor Environment Analysis and Structure-Bioactivity Relationships

Abstract

Inhalation of air-borne microorganisms and components thereof can cause illnesses and diseases. However, lack of specific and sensitive methods for exposure assessment can pose problems in predicting health outcomes. Characterization of microbial load from indoor environments using gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) and/or tandem mass spectrometry (GC-MSMS) as well as various bioassays (Limulus assay and in-vitro cell stimulation analysis using the A549 cell line) was the focus of this thesis. GC-MS and GC-MSMS make use of the fact that microorganisms contain unique chemical structures that can be used as markers. Three chemical markers, namely, 3-hydroxy fatty acids (3-OH FAs; marker of LPS), muramic acid (MuAc; marker of peptidoglycan) and ergosterol (marker of fungi) were analyzed. The specificity of GC-MSMS was superior to GC-MS with regard to co-eluting compounds. The selective hydrolysis and extraction methods enabled simultaneous analysis of different markers from a single sample aliquot. The amounts of LPS present in house dust (calculated using 3-OH FAs with chain lengths of 10-14 carbon atoms) and bioactivity (as measured by Limulus analysis) gave correlation coefficients (r) of 0.60 and 0.88. In a study involving exposure of human subjects to airborne material in a swine confinement building, serum IL-6 correlated with 3-OH FAs and MuAc (r=0.50 and r=0.46 respectively). MuAc also related with change in body temperature (r=0.57). In-vitro analysis using the cell line A549 showed house dust to be a potent stimulant of IL-8 and IL-6 production by this cell line.

Abstract (Swedish)

Popular Abstract in Swedish

Otillfredsställande inandningsluft på bl a arbetsplatser har satts i samband med utveckling av olika akuta och kroniska symptom såsom allergi, astma och kronisk bronkit. Vi vet att bakterier och svamp producerar ett stort antal ämnen som verkar irriterande eller är allergiframkallande. Misstankar har därför riktas mot olika mikrobiologiska ämnen i luften såsom endotoxin, peptidoglykan och olika ämnen i mögelsvamp, men orsakssambanden är oklara. En av förklaringarna till de motstridiga resultat som rapporterats i litteraturen avseende samband mellan mikroorganismer i inandningsluft och symptom är att det saknats tillfredsställande mätmetoder. Odling detekterar endast levande mikrober, mikroskopimetoder är svåra att tillämpa när provmatriserna är komplexa, och Limulus-baserade metoder för mätning av endotoxiner har begränsad reproducerbarhet. Det föreligger inga etablerade metoder för bestämning av bakteriellt peptidoglykan.



I denna avhandling har jag tillämpat en analytisk-kemisk mätmetod för bestämning av vissa specifika mikrobmarkörer såsom 1) 3-hydroxyfettsyror, markörer för endotoxin, 2) muraminsyra, markör för peptidoglykan, samt 3) ergosterol, en specifik svampsterol. Metoden, som kallas gaskromatografi-masspektrometri (GC-MS), baseras på att mikrober innehåller unika kemiska strukturer som inte återfinns i naturen i övrigt. GC är en separationsmetod medan MS kan ses som en specifik detektor. Genom att mäta nämnda kemiska markörer registreras båda levande och avdödade mikrober. Detta koncept erbjuder möjlighet till karakterisering och kvantifiering av även små mängder mikrobiologiskt material med hög specificitet och reproducerbarhet. Om provmatrisen är mycket komplex och halten av provmolekylerna mycket låg är specificiteten hos "vanlig" GC-MS inte tillräcklig, utan GC-tandem-MS (GC-MSMS) erfordras. Denna senare metod har under de senaste åren blivit praktisk att använda eftersom en ny typ av MS-instrument har sett dagens ljus, nämligen s.k ion-trap-instrument.



För att det skall vara möjligt att bestämma de mikrobiella markörerna med GC-MS (eller GC-MSMS) erfordras att de först frigörs från större strukturer i mikroorganismerna samt att de är tillräckligt flyktiga för att kunna separeras med GC. Det förra görs med olika hydrolysförfarande och det senare medelst kemisk derivatisering. Jag har utvecklat olika hydrolys- och extraktionsmetoder så att olika typer av markörer kan analyseras utifrån ett enda provmaterial. Dessutom har jag lagt ner mycket arbete på att hitta de rätta derivaten så att högsta möjliga analytisk specificitet och känslighet kunde uppnås. Detta har varit ett kontinuerligt arbete, och inte förrän i sista delarbetet (artikel V) har dessa optimerade metoder använts fullt ut.



Resultaten av dessa analyser har korrelerats till biologisk aktivitet och odling. Särskilt intressant är fyndet att endotoxinmolekylens biologiska aktivitet (mätt med Limulus-test) vid luftprovtagning korrelerar väl till 3-hydroxyfettsyrasvar bara om vissa av dessa syror ingår i beräkningarna. Dessa resultat verifierar tidigare fynd på renodlat "kemisk" nivå. Intressant var också att konstatera att analyssvaren korrelerade väl till en rad fysiologiska effekter vid individexponering för damm såsom förhöjda nivåer av vissa interleukiner i blod samt feberreaktioner. Fortsatta försök lär erfordras för att utröna om våra analytiska metoder skall visa sig vara pålitliga för att kunna bedöma risk för ohälsa orsakad av otillfredsställande (mikrobiologiskt kontaminerad) inandningsluft.

• author: Saraf, Anita
• supervisor: [unknown] [unknown]
• opponent: Docent Tunlid, Anders, Dept of Microbial Ecology, University of Lund
• organization: Division of Medical Microbiology
• publishing date: 1999
• type: Thesis
• publication status: published
• subject: Microbiology in the medical area
• keywords: Limulus assay, bioactivity, ergosterol, muramic acid, LPS, organic dust, GC-MS, GC-MSMS, Microbiology, bacteriology, virology, mycology, Mikrobiologi, bakteriologi, virologi, mykologi
• pages: 136 pages
• defense location: Rune Grubb salen, BMC, Sölvegatan 19, Lund
• defense date: 1999-09-09 10:15:00
• external identifiers: other:ISRN: LUMEDW/MEMI-1037-SE
• ISBN: 91-628-3664-1
• language: English
• LU publication?: yes
• id: 5302d4e5-d8ff-4130-b5da-17b2754ccaaf (old id 39788)
• date added to LUP: 2016-04-04 11:23:52
• date last changed: 2018-11-21 21:04:36