Advanced

Alpha-1-microglobulin, heme-binding protein, reductase and antioxidant

Allhorn, Maria LU (2005) In Lund University, Faculty of Medicine Doctoral Dissertation Series 2005:58
Abstract (Swedish)
Popular Abstract in Swedish

Alla levande organismer består av celler som tillsammans med molekyler generellt kallade extracellulär matrix bildar en vävnad. Celler innehåller fyra huvudgrupper av byggstenar: socker, fettsyror, aminosyror och nukleotider, vilka i tur och ordning bildar kolhydrater, fetter, proteiner och nukleinsyror. I vävnaderna pågår en ständig omsättning av byggstenarna och molekylerna. För denna omsättning krävs syre, som tillförs kroppen via inandningsluften. I aeroba celler (celler som använder sig av syre) förekommer en ständig produktion av fria radikaler. En fri radikal är en atom- eller molekylgrupp som har en eller flera oparade elektroner i yttersta elektronskalet. Radikaler är mycket... (More)
Popular Abstract in Swedish

Alla levande organismer består av celler som tillsammans med molekyler generellt kallade extracellulär matrix bildar en vävnad. Celler innehåller fyra huvudgrupper av byggstenar: socker, fettsyror, aminosyror och nukleotider, vilka i tur och ordning bildar kolhydrater, fetter, proteiner och nukleinsyror. I vävnaderna pågår en ständig omsättning av byggstenarna och molekylerna. För denna omsättning krävs syre, som tillförs kroppen via inandningsluften. I aeroba celler (celler som använder sig av syre) förekommer en ständig produktion av fria radikaler. En fri radikal är en atom- eller molekylgrupp som har en eller flera oparade elektroner i yttersta elektronskalet. Radikaler är mycket reaktionsbenägna. Exempel på radikaler är hydroxylradikalen eller syreradikalen som tillsammans med väteperoxid tillhör en grupp reaktiva syreföreningar ROS (Reactive Oxygen Species). Skador som kan uppstå vid angrepp av fria radikaler, s k oxidationsskador, kan medföra att cellerna och molekylerna inte längre fungerar som de ska. En antioxidant är ett ämne som motverkar oxidation och skyddar cellerna mot angrepp av fria radikaler. C-vitamin, E-vitamin eller beta-karoten är exempel på antioxidanter. Det finns även ett flertal enzymsystem som superoxiddismutaser (SOD), katalas och glutationperoxidaser som försvarar kroppen mot fria radikaler. En obalans mellan reaktiva syreföreningar och antioxidanter med övervikt av de förra brukar betecknas som oxidativ stress, vilket leder till uppkomst av bland annat hjärt/kärlsjukdomar, ledgångsreumatism och inflammatoriska sjukdomar.



Häm utgör en funktionell grupp hos syretransporterande hämproteiner som hemoglobin och myoglobin och det elektrontransporterande proteinet cytokrom c. Hämgruppen består av en porfyrinring och järnatom. I hemoglobin och myoglobin förekommer järn i sin reducerade form (Fe2+ ) medan i cytokrom c pendlar järnformen mellan Fe2+ och Fe3+. Normalt är hämproteiner lokaliserade till inre delen av cellen och bevaras reducerade med hjälp av intracellulära inhibitorer som förhindrar oxidationen. Vävnadsskador vid olika sjukdomstillstånd orsakar extracellulär frisättning av fritt järn och proteinbundet häm. Olika oxiderade hämformer kan sedan bildas och ge upphov till oxidativ stress genom formation av ROS vilket i sin tur leder till förändringar av proteiner och lipider, cell- och vävnadsdöd och inflammation. Exponerat häm är därmed en viktig faktor i sjukdomsförloppet under inflammation. Plasma innehåller häm- och järnbindande proteiner som haptoglobulin, transferrin, albumin och hemopexin likaså askorbinsyra och vitamin E. Hämoxygenas är ett intracellulärt enzym som katalyserar hämnedbrytningen av häm till biliverdin, CO och fritt järn. Detta skyddssystemet är dock inte tillräckligt under extravaskulär hemolys eller kronisk inflammation.



a1m är ett litet protein som förekommer i både blod och vävnader. a1m tillverkas i levern som ett förstadium i form av ett dubbelprotein tillsammans med ett annat protein bikunin. a1m och bikunin utsöndras var för sig till blodet och har därefter inget strukturellt eller funktionellt samröre. a1m finns i fri form och bundet till flera andra tyngre proteiner, t.ex. IgA, albumin och protrombin. Fritt a1m filtreras från blodet i njurarna och en liten mängd finns i urin. Både fritt och komplexbundet a1m transporteras till alla vävnader. a1m tillhör en proteinfamilj kallad lipokaliner, en familj av proteiner som är formade på liknande sätt, och som bland annat har för uppgift att transportera olika molekyler. a1m är brunfärgat. Man vet inte den riktiga funktionen för a1m, men man har visat att proteinet sänker immunförsvaret och motverkar inflammation. a1m förhindrar kristallisering av calcium oxalat (njursten) i njure och binder toxiska degradations produkter från kynurenin, en metabolit som kommer från degradation av aminosyran tryptofan.



Resultat i avhandlingen



Syftet med denna avhandlingen har varit att studera strukturen och funktionen av a1-microglobulin.



a1m binder häm (artikel I och II)



Innan jag påbörjade mitt första projekt hade vi sett en interaktion mellan a1m och hemoglobin i samband med undersökningar gjorda på a1m renat från moderkakor (placenta). Vi ville därför titta närmare på interaktionen mellan hemoglobin, häm och a1m och blandade a1m med hämoglobin och trasiga erytrocyter.



Vi har kommit fram till att a1m kan binda häm och det uppstår också en klyvd form av a1m (t-a1m) som dessutom bryter ned häm. Normal urin innehåller t-a1m, och urin från patienter med skadade röda blodkroppar har förhöjda koncentrationer av t-a1m, vilket pekar på att förekomsten av t-a1m är biologiskt relevant. Det har visats sig att a1m i blodplasma binder häm i samma kvantiteter som albumin, fast koncentrationen av albumin i plasma är 1000 gånger högre än koncentrationen av a1m. Vi har också konstaterat att a1m binder häm i olika arter vilket tyder på att den egenskapen är välbevarad i evolutionen och därmed av stor betydelse.



a1m i kroniska sår och inflammation (artikel III och VI)



Inflammation är ett försvarssystem avsedd for att eliminera skadliga substanser vid bakterieinfektion eller vävnadsskador och på så sätt reparera omgivande vävnad. Om inflammatoriska processer inte avtar vid rätt tidpunkt, frisätts en ökad mängd ROS och proteaser från vita blodkroppar, med ytterligare vävnadsskador som följd.



Kroniska venösa sår utmärks av en utbredd och länge pågående inflammation, där häm och järn, både i fri form och i hämgruppen, har utpekats som viktiga sjukdomsframkallande faktorer. Därför har vi valt kroniska bensår som en modell för att studera funktion av a1m som ett skydd mot fritt häm. Vi har undersökt koncentration, fördelning och biokemiska egenskaper hos a1m /t-a1m i kroniska sårvätskor. Som förväntat, har de visat sig innehålla både fritt järn, häm, a1m och t-a1m. Vi kunde också se att a1m, bredvid albumin, var det huvudsakliga hämbindande proteinet i sårvätskorna.



Inflammatoriska processer i kroniska sår leder till en ökad aktivitet av kollagenaser, proteiner som degraderar kollagen. Vi har koncentrerat oss på en av dessa, matrixmetalloproteinas-9 som deltar i omsättning av extracellular matrix. Detta protein tros försämra sårläkningsprocessen genom att degradera vävnad. I arbete VI har vi undersökt om a1m kan påverka frisättningen av MMP9 i hudvävnad. Vi har studerat hudprover och enstaka hudceller, och sett att både häm och hemoglobin ledder till kraftigt ökad frisättning av MMP-9, och att a1m kunde motverka dessa effekter. Sammanfattningsvis tror vi att a1m kan utgöra en skyddsmekanism mot höga halter fritt häm och järn under hudsårläkning och skydda hudvävnaden mot giftiga och inflammatoriska effekter orsakade av fritt exponerat häm och extracellulärt-hemoglobin.



a1m som ett reduktas och en antioxidant (artikel IV och V)



Vi har funnit att a1m reducerar cytokrom c, methemoglobin och fritt järn, och på så sätt gör molekylerna mindre skadliga. För att kunna göra detta måste a1m själv vara reducerad och ha ett överskott av elektroner som hämtas från biologiska elektronkällor som NADH och vitamin C. De aminosyrorna i a1m som är ansvariga för proteinets färg, är också av betydelse för reduktionsreaktionen. Borttagning av dessa medför en utebliven reduktion. Vi har visat att a1m är en antioxidant. a1m skyddar kollagen och kolesterolbärande molekyler (LDL) mot skadlig oxidation orsakad av oxidanter som hem, hemoglobin, väteperoxid och järn. Våra resultat visar också att a1m inte enbart förhindrar oxidativa förändringar, men också tar bort redan bildade förändringar. a1m har hittats i LDL partikeln, vilket tyder på att a1m är ett naturligt förekommande protein i LDL. a1m binder specifikt till LDL. a1m skyddar cellmembraner och inre delen av cellen mot fria radikaler. (Less)
Abstract
This thesis describes structural and functional studies of alpha-1-microglobulin (a1m), a 26 kDa plasma and tissue protein that is evolutionarily well-conserved and belongs to the lipocalin superfamily. The lipocalins are polypeptides of 160-190-amino acids that are folded into an 8-stranded beta-barrel forming a pocket with a hydrophobic interior. a1m carries heterogeneous yellow-brown chromophores covalently bound to one unpaired cysteinyl (C34) and three lysyl residues (K92, 118, 130) located at the entrance to the pocket. a1m is found both in free form and as a complex with IgA in blood and interstitial tissues.



We show here that a1m is involved in heme metabolism. The protein binds to heme and, when exposed to... (More)
This thesis describes structural and functional studies of alpha-1-microglobulin (a1m), a 26 kDa plasma and tissue protein that is evolutionarily well-conserved and belongs to the lipocalin superfamily. The lipocalins are polypeptides of 160-190-amino acids that are folded into an 8-stranded beta-barrel forming a pocket with a hydrophobic interior. a1m carries heterogeneous yellow-brown chromophores covalently bound to one unpaired cysteinyl (C34) and three lysyl residues (K92, 118, 130) located at the entrance to the pocket. a1m is found both in free form and as a complex with IgA in blood and interstitial tissues.



We show here that a1m is involved in heme metabolism. The protein binds to heme and, when exposed to hemoglobin or erythrocyte membranes, a processed form of a1m, t-a1m (t=truncated), with a free thiol group in position 34 and lacking the C-terminal tetrapeptide, is released from free a1m and the IgA-complex. The processed t-a1m has an intense yellow-brown colour and has properties suggestive of heme-degradation enzyme activity. The processed t-a1m-form is found in urine as well as in chronic ulcer fluids, where it is co-localized with heme. Chronic ulcers are characterized by long-standing inflammation and hemolysis with a continuous release of heme and iron, which are considered to be pathogenetic factors. These findings suggest that a1m is involved in the defence against heme-mediated oxidation.



We also found that a1m has enzymatic reductase and dehydrogenase properties. Thus, a1m reduces cytochrome c, methemoglobin, and free iron to their non-oxidized forms, using the biological electron donors NADH and ascorbic acid as electron-supplying co-factors. Recombinant a1m-variants lacking C34 and/or the chromophore-carrying K92, 118 and 130 have less reducing activity, suggesting that the thiol group in position 34 as well as the nearby located lysyl groups are involved in the reaction. The protein has antioxidation properties, i.e. it inhibits the oxidation of biological targets as collagen and LDL, by the pro-oxidants heme, oxidized hemoglobin, hydrogen peroxide and oxidized iron. a1m can even remove some of the oxidation products on collagen and LDL after they have been formed. a1m has been found in LDL from human plasma, suggesting that a1m is a naturally occurring component of LDL. In vitro, a1m binds specifically to LDL-particles. a1m inhibits the hydroxyl radical-induced peroxidation of purified erythrocyte membranes. a1m can also inhibit the generation of intracellular reactive oxygen species in K562 cells after exposure of the cells to heme and hydrogen peroxide as well as in resting cells.



In conclusion, a1m may be regarded as a heme-metabolising protein, a new regulator of oxidation and an extracellular antioxidant. (Less)
Please use this url to cite or link to this publication:
author
supervisor
opponent
  • Docent Arner, Elias, Karolinska Institutet, Inst. för medicinsk biokemi och biofysik
organization
publishing date
type
Thesis
publication status
published
subject
keywords
reduction, inflammation, chronic ulcers, collagen, low density lipoproteins, Medicin (människa och djur), Medicine (human and vertebrates), antioxidation, heme, hemoglobin, alpha-1-microglobulin, lipocalin
in
Lund University, Faculty of Medicine Doctoral Dissertation Series 2005:58
pages
134 pages
publisher
Department of Clinical Sciences, Lund University
defense location
GK-salen, BMC, Sölvegatan 19, Lund
defense date
2005-06-03 10:00
ISSN
1652-8220
ISBN
91-85439-62-2
language
English
LU publication?
yes
id
5770929f-f5a7-4781-bb97-b1332c30b247 (old id 544920)
date added to LUP
2007-09-07 15:18:24
date last changed
2016-09-19 08:44:52
@phdthesis{5770929f-f5a7-4781-bb97-b1332c30b247,
  abstract     = {This thesis describes structural and functional studies of alpha-1-microglobulin (a1m), a 26 kDa plasma and tissue protein that is evolutionarily well-conserved and belongs to the lipocalin superfamily. The lipocalins are polypeptides of 160-190-amino acids that are folded into an 8-stranded beta-barrel forming a pocket with a hydrophobic interior. a1m carries heterogeneous yellow-brown chromophores covalently bound to one unpaired cysteinyl (C34) and three lysyl residues (K92, 118, 130) located at the entrance to the pocket. a1m is found both in free form and as a complex with IgA in blood and interstitial tissues.<br/><br>
<br/><br>
We show here that a1m is involved in heme metabolism. The protein binds to heme and, when exposed to hemoglobin or erythrocyte membranes, a processed form of a1m, t-a1m (t=truncated), with a free thiol group in position 34 and lacking the C-terminal tetrapeptide, is released from free a1m and the IgA-complex. The processed t-a1m has an intense yellow-brown colour and has properties suggestive of heme-degradation enzyme activity. The processed t-a1m-form is found in urine as well as in chronic ulcer fluids, where it is co-localized with heme. Chronic ulcers are characterized by long-standing inflammation and hemolysis with a continuous release of heme and iron, which are considered to be pathogenetic factors. These findings suggest that a1m is involved in the defence against heme-mediated oxidation.<br/><br>
<br/><br>
We also found that a1m has enzymatic reductase and dehydrogenase properties. Thus, a1m reduces cytochrome c, methemoglobin, and free iron to their non-oxidized forms, using the biological electron donors NADH and ascorbic acid as electron-supplying co-factors. Recombinant a1m-variants lacking C34 and/or the chromophore-carrying K92, 118 and 130 have less reducing activity, suggesting that the thiol group in position 34 as well as the nearby located lysyl groups are involved in the reaction. The protein has antioxidation properties, i.e. it inhibits the oxidation of biological targets as collagen and LDL, by the pro-oxidants heme, oxidized hemoglobin, hydrogen peroxide and oxidized iron. a1m can even remove some of the oxidation products on collagen and LDL after they have been formed. a1m has been found in LDL from human plasma, suggesting that a1m is a naturally occurring component of LDL. In vitro, a1m binds specifically to LDL-particles. a1m inhibits the hydroxyl radical-induced peroxidation of purified erythrocyte membranes. a1m can also inhibit the generation of intracellular reactive oxygen species in K562 cells after exposure of the cells to heme and hydrogen peroxide as well as in resting cells.<br/><br>
<br/><br>
In conclusion, a1m may be regarded as a heme-metabolising protein, a new regulator of oxidation and an extracellular antioxidant.},
  author       = {Allhorn, Maria},
  isbn         = {91-85439-62-2},
  issn         = {1652-8220},
  keyword      = {reduction,inflammation,chronic ulcers,collagen,low density lipoproteins,Medicin (människa och djur),Medicine (human and vertebrates),antioxidation,heme,hemoglobin,alpha-1-microglobulin,lipocalin},
  language     = {eng},
  pages        = {134},
  publisher    = {Department of Clinical Sciences, Lund University},
  school       = {Lund University},
  series       = {Lund University, Faculty of Medicine Doctoral Dissertation Series 2005:58},
  title        = {Alpha-1-microglobulin, heme-binding protein, reductase and antioxidant},
  year         = {2005},
}