Iron in Haem Biosynthesis. Structural Studies of Ferrochelatase and Frataxin.

Abstract

Ferrochelatase catalyses the synthesis of heme by inserting Fe(II) into protoporphyrin IX. The structure of ferrochelatase from yeast has been determined (2.4 Å). The structure is homodimeric with each of the monomer made up of two Rossmann type domains with an active-site cleft between them.



Metal binding studies with Co(II) and Cd(II) ions reveal the metal binding residues as being the His-Glu couple, His235 and Glu314. In addition Cd(II) binds to a second site coordinating Glu97, His317 and Glu326.Metal binding studies on the bacterial ferrochelatase from Bacillus subtilis revealed an Fe(II) bound to the same His-Glu couple, His183 and Glu264. The structure was refined to 1.7 Å. Site-directed mutants in the active site were studied and four of them were structurally determined, Tyr13Phe (2.4 Å), Lys87Ala (1.2 Å), His183Cys (2.1 Å) and His183Ala (2.4 Å). In combination with biochemical studies a likely mechanism of metal binding is suggested to involve the His-Glu couple.



The porphyrin inhibitor N-MeMP binds with high affinity to ferrochelatase. Cu(II) insertion into N-MeMP was studied by a time series of soaking N-MeMP:ferrochelatase crystals. Cu(II) was seen accumulating into the ring while density for the N-methyl group was seen decreasing. Mass spectrometry studies on porphyrin metallation revealed that ferrochelatase catalyse metal insertion. Cu(II) was more efficiently inserted than Zn(II) which contrasts with studies on the substrate protoporphyrin IX. The most probable reason for the discrepancy is the degree of distortion of the macro-cycle, which therefore could be of importance in metal selectivity.



Co-crystal structures of two different inhibitors were determined. N-MeMP crystallised with His183Ala variant of ferrochelatase revealed a different isomer, from the racemic mixture, located in the binding cleft compared to previously determined wild-type structure. The structure was refined to 2.4 Å. His183 is put forward as an important residue controlling binding specificity. The other inihibitor, 2,4-disulphonic deuteroporphyrin IX, has two bulky side-chains and was seen trapped on its way into the binding cleft of the His183Cys ferrochelatase variant (2.1 Å).



Frataxin is a mitochondrial protein involved in iron delivery and storage. The crystal structure of trimeric frataxin from yeast was determined to 3.0 Å. The structure has a propeller-like shape with the monomers making up the wings. Each monomer is folded as an alpha/beta sandwich. The same fold was also found in other metallochaperones. In an EM-reconstruction of the 24-meric oligomer the trimers were located at the corners with octahedral symmetry. Eight trimer structures could be docked into the envelope. Frataxin seems to be more dynamic in terms of its bi-functionality and iron storage properties compared to ferritin.

Abstract (Swedish)

Popular Abstract in Swedish

Järn är ett metalliskt grundämne som tillhör övergångselementen i det periodiska systemet. Den kemiska beteckningen är Fe (av det latinska ordet ferrum). Järn har visat sig vara ett väldigt viktigt ämne för i princip allt liv på vår planet. Främst finns det bundet till olika proteiner i form av järnsvavelkluster och hem.



Hem är en liten molekyl som finns i de allra flesta organismer, den tillhör en grupp molekyler som kallas för tetrapyrroler. Tetrapyrroler kallas ibland ?livets pigment?, eftersom de ofta är starkt färgade. Klorofyll är ett välkänt exempel. Tetrapyrrolerna är inblandade i viktiga biologiska processer såsom fotosyntes och andning. Hem finns bundet till en rad olika proteiner såsom hemoglobin, flera cytokromer, katalas och peroxidas. Mest känt är nog det hemoglobin som transporterar luftens syre från lungorna till alla kroppens vävnader.



Det enzym som katalyserar det sista reaktionssteget i den biokemiska hemsyntesen heter ferrokelatas. Enzymet sätter in ett järn i mitten av protoporfyrin IX (en tetrapyrrol-ring). Hur denna reaktion katalyseras är inte helt klarlagt i alla detaljer, min forskning har fokuserat på just denna fråga och nu, efter snart fem år i projektet, kan ytterliggare en liten pusselbit läggas på plats.



Ett annat protein, som jag har arbetat med är relaterat till ferrokelatas och kallas frataxin. Mycket tyder på att frataxin levererar järn till ferrokelatas. Frataxin finns i cellens mitokondrier och det har två huvuduppgifter, att leverera järn och att lagra järn i en ogiftig form som cellen senare kan använda.



Frataxin har fått sitt namn efter en ganska ovanlig neurologisk sjukdom som kallas Friedreichs ataxi. Patienter som lider av Friedrichs ataxi har en defekt gen som gör att de inte kan producera tillräckligt med frataxin. Nikolaus Friedrich beskrev sjukdomen i slutet av 1800-talet som en nedbrytande nervsjukdom med störningar av koordinationsförmågan och nedsatt hjärtfunktion. Sjukdomen är ärftlig och symptomen visar sig nästan alltid i tidig ålder.



Metod



För att undersöka den tredimensionella strukturen hos ferrokelatas och frataxin på en atomär nivå har jag använt röntgenkristallografi. För att röntgenkristallografin ska lyckas måste man se till att proteinmolekylerna är packade på ett regelbundet sätt. Det gör man genom att kristallisera proteinet. Proteinkristallen exponeras sedan för röntgenstrålning med en våglängd på ungefär en tiondels nanometer. Strålen sprids, diffrakteras i vissa riktningar och detekteras, numera oftast med en CCD-detektor (Charge Coupled Device). Detektorn producerar diffraktionsmönster, som omvandlas till siffror. Med datorns hjälp kan så småningom en proteinstruktur lösas och visualiseras i bild.



Min forskning



Ferrokelatas är ett protein som finns i de flesta organismer. Jag har arbetat med ferrokelatas från både jäst och från bakterien B. subtilis. Vår strukturbestämning av ferrokelatas från jäst visar både likheter och olikheter med de två andra ferrokelatasstrukturer som finns: från B. subtilis och från människa. I likhet med det mänskliga proteinet bildar jästferrokelatas en funktionell dimer, till skillnad från B. subtilis som har en monomerisk struktur.



För att studera metallbindningen tillsatte vi metalljoner av olika slag till proteinkristaller av ferrokelatas från jäst och från bakterien B. subtilis. Därefter kunde vi med röntgenkristallografi bestämma om och var metallen sätter sig på proteinet. På så sätt kunde bindningssätet för metallen bestämmas.



En annan viktig aspekt i den enzymatiska metalleringen av protoporfyrin IX är hur tetrapyrrolen binder till ferrokelatas. Vi har strukturbestämt B. subtilis ferrokelatas med två porfyrininhibitorer som binder till enzymet på olika sätt. En inhibitor är en molekyl som blockerar ett enzyms katalytiska funktion. I allmänhet går detta till så att inhibitorn binder till enzymet på ett sådant sätt att dess aktivitet helt eller delvis försvinner.



Vi lyckades strukturbestämma den trimeriska formen av frataxin från jäst. Det visade sig att den har en karakteristisk propellerform som tidigare observerats i ferritiner. Ferritiner är stora järnlagringsmolekyler som tar hand om överflödigt järn. Med hjälp av elektron-mikroskopi (EM) på större frataxinpartiklar kunde en 24merisk frataxinvariant strukturbestämmas. Åtta trimerer kunde dockas in i EM-modellen. Tillsammans ger de båda oligomer-formerna en inblick i hur frataxin kan fungera både som leverantör av och lagringsdepå för järn.

• author: Karlberg, Tobias
• supervisor: Salam Al-Karadaghi
• opponent: Docent Papageorgiou, Anastassios, Turku Centre for Biotechnology
• organization: Biochemistry and Structural Biology
• publishing date: 2006
• type: Thesis
• publication status: published
• subject: Biological Sciences
• keywords: Naturvetenskap, Natural science, Molekylär biofysik, Molecular biophysics, Biomedicinska vetenskaper, Biomedical sciences, protein crystallography, ferrochelatase, haem biosynthesis, iron, frataxin
• pages: 134 pages
• defense location: Kemicentrum sal F
• defense date: 2006-05-05 10:30:00
• ISBN: 91-7422-115-9
• language: English
• LU publication?: yes
• additional info: Tobias Karlberg, David Lecerof, Monica Gora, Germund Silvegren, Rosine Labbe-Bois, Mats Hansson and Salam Al-Karadaghi. 2002. Metal binding to Saccharomyces cerevisiae ferrochelatase. Biochemistry, vol 41 pp 8. American Chemical Society; Stepan Shipovskov, Tobias Karlberg, Michel Fodje, Mattias D. Hansson, Gloria C. Ferreira, Mats Hansson, Curt T. Reimann and Salam Al-Karadaghi. 2005. Metallation of the transition-state inhibitor N-methyl mesoporphyrin by ferrochelatase: implications for the catalytic reaction mechanism. Journal of Molecular Biology, vol 352 pp 10. Elsevier Ltd.; Tobias Karlberg, Raymond K. Yengo, Hege O. Thorvaldsen, Mattias D. Hansson, Mats Hansson and Salam Al-Karadaghi. 2006. Specificity of the porphyrin binding pocket of ferrochelatase. pp 9. (manuscript); Mattias D. Hansson, Tobias Karlberg, Muhammad Arys Rahardja, Salam Al-Karadaghi and Mats Hansson. 2006. Amino acid residues His183 and Glu264 in Bacillus subtilis ferrochelatase direct and facilitate the insertion of metal ion into protoporphyrin IX. (manuscript); . 2006. The structures of frataxin oligomers reveal a novel mechanism for the delivery and detoxification of iron. (submitted); Tobias Karlberg, Ulrika Schagerlöf, Oleksandr Gakh, Sungjo Park, Ulf Ryde, Martin Lindahl, Kirstin Leath, Elspeth F. Garman, Grazia Isaya and Salam Al-Karadaghi. 2006. The structures of frataxin oligomers reveal a novel mechanism for the delivery and detoxification of iron. pp 18. (submitted)
• id: 60a4b99a-517e-4b9e-b19c-f1e39769073a (old id 546607)
• date added to LUP: 2016-04-04 12:00:07
• date last changed: 2018-11-21 21:08:26