Mechanisms for Targeting of Proteins to Secretory Lysosomes of Haematopoietic Cells

Abstract

The cells of the innate immune system are essential for the host's first line defence against infection. Among these cells the neutrophil granulocyte has a central role by the production of antibiotic proteins and peptides. These are targeted for storage in secretory lysosomes and other neutrophil granules for subsequent release by regulated secretion in an inflammatory process. However, the granule content is very potent and may cause tissue damage when released. Basic knowledge about biosynthesis, targeting and secretion of these proteins is therefore important for the understanding of the role of neutrophils in the emergence of inflammatory diseases.



The aim of this thesis was to define mechanisms underlying targeting of proteins to secretory lysosomes of haematopoietic cells.



For this purpose, we investigated the role of protein aggregation in the targeting of luminal proteins to secretory lysosomes. The results suggested that aggregation does not facilitate sorting-for-entry into forming granules destined for the secretory lysosomes. Rather, a native conformation is required in order to allow retention and sorting and avoid elimination from the cell by constitutive secretion.



We also compared the ability of a native versus a non-native protein for endosomal uptake. The results indicated a native conformation to be required for internalization of cell surface located proteins.



Taken together, these results led to suggestions about protein quality controls existing at post-ER levels in the secretory pathway, possibly operating in the Golgi complex and at the plasma membrane. In addition, the results indicated the suggested post-ER protein quality controls to eliminate proteins from the cell by constitutive secretion, instead of targeting failing proteins for intracellular degradation as is observed in ER protein quality control.



Moreover, targeting for storage of a protein such as the soluble TNF receptor to secretory lysosomes was achieved by addition of a transmembrane sorting signal. This might be useful in the use of secretory lysosomes of haematopoietic cells as vehicles for targeting of therapeutic molecules for local release at sites of persistent inflammation.

Abstract (Swedish)

Popular Abstract in Swedish

Kroppens immunförsvar, vars uppgift är att skydda oss mot infektioner, består av ett antal olika celltyper som till stor del finns i blodet. Immunförsvaret kan indelas i två delar; ett medfött försvar som är likadant hos alla individer och ett försvar som byggs upp under individens livstid. Det senare utformas olika beroende på vilka bakterier och virus som individen utsätts för. En viktig celltyp i det medfödda immunförsvaret är de s.k. neutrofilerna som tillhör de vita blodkropparna. Deras uppgift är att vara bland de första immuncellerna på plats och skydda kroppen i det akuta skedet, då kroppen får ovälkommet besök av potentiellt farliga bakterier. Neutrofilerna transporteras med blodet till infektionsstället och vid ankomsten lämnar de blodkärlen och går ut i vävnaden där de ?äter upp? inkräktarna. Inuti neutrofilerna oskadliggörs sedan bakterierna av ett antal bakteriedödande proteiner som finns lagrade i små blåsor, s.k. granula, i cellen. Dessa proteiner kan dock ibland komma ut och orsakar då skador på den omkringliggande vävnaden. Neutrofilen kan även stimuleras av faktorer i den inflammatoriska processen att utsöndra de toxiska granula-proteinerna till omgivningen. Upplagringen av de bakteriedödande proteinerna måste vara väl reglerad så att dessa kan frisättas vid rätt tillfälle och på rätt plats för att undvika vävnadsskada. I mitt arbete har jag därför koncentrerat mig på att studera hur transport och upplagring av proteiner i granula går till, i syfte att hitta de styrande mekanismerna. Dessa skulle i så fall kanske kunna påverkas för att undvika ogynnsam inflammation.



Dels har jag studerat effekten av aggregation, dvs. sammanhopning av proteiner, för transporten av nytillverkade proteiner till granula. Aggregation skulle kunna vara ett sätt att fylla granula med innehåll.



I studien undersöktes både naturligt och modifierat protein. Resultaten visade dock att endast naturligt protein kunde lagras och att aggregation av proteiner därmed inte tycks vara tillräckligt som mekanism för att styra proteinerna till granula. Istället utsöndrades de icke-naturliga proteinerna från cellen, kanske ett sätt för naturlig eliminering av felaktiga proteiner.



Sedan undersöktes upptaget av proteiner på cellens yta för transport till granula, med avsikt att studera skillnader i transport via cellmembranet mellan naturligt och icke naturligt protein. Resultaten visade att ett i cellen naturligt protein kunde tas in från ytan för upplagring i granula, medan ett modifierat protein inte togs upp utan istället utsöndrades.



Sammantaget antyder resultaten att proteiner måste passera en ?kvalitetskontroll?, som ?underkänner? och sorterar bort onaturliga eller felaktiga proteiner från att upplagras i granula. En sådan kvalitetskontroll har redan rapporterats i en struktur i cellen som kallas det endoplasmatiska retiklet, där icke godkända proteiner skickas till nedbrytning i s.k. proteasomer inuti cellen. Resultaten från dessa experiment tyder dock på att proteinerna kan utsättas för kvalitetskontroll även i en struktur kallad Golgi-apparaten, samt på cellens yta, dvs. på det s.k. cellmembranet. Kvalitetskontroll av proteiner i dessa strukturer, som dessutom inte tycks skicka felaktiga proteiner till nedbrytning utan istället utsöndrar dem från cellen, finns inte rapporterad tidigare. Kvalitetskontroll i Golgi-apparaten har dock föreslagits existera i jästceller.



Som ovan nämnts, kan frisättning av bakteriedödande proteiner vid en inflammatorisk reaktion orsaka vävnadsskador. Det är därför viktigt att inflammationsprocessen regleras ordentligt och att den avslutas så snart de invaderade mikroorganismerna oskadliggjorts. En icke fungerande reglering av det inflammatoriska försvaret kan i kombination med ärftliga faktorer bidra till uppkomst av kronisk inflammatorisk sjukdom såsom reumatisk ledsjukdom.



I mitt arbete har jag därför även intresserat mig för hur man kan dämpa den inflammatoriska reaktionen, i syfte att minska vävnadsskadorna, då de naturliga regleringsmekanismerna satts ur spel.



Ett sätt skulle kunna vara att, med hjälp av genteknik, använda sig av neutrofila granula för upplagring av anti-inflammatoriska proteiner. Dessa skulle då kunna styras direkt till inflammationsstället och där frisätta de inflammationsdämpande proteinerna.



Därför undersöktes möjligheten att förse ett protein, som normalt inte upplagras i neutrofila granula, med en ?upplagringssignal? från ett annat protein som normalt styrs till granula. Här valdes det att försöka lagra upp ett protein som kan oskadliggöra så kallad tumörnekrotisk faktor (TNF), som har stor inblandning i den vävnadsförstörelse som kan uppstå vid inflammation. Resultaten visade att proteinet transporterades till granula för upplagring där. Detta antyder att neutrofila granula skulle kunna användas som bärare av terapeutiska proteiner för att lokalt dämpa inflammatoriska processer med avsikt att minska vävnadsskador. Detta koncept skulle även kunna tillämpas på andra celler i immunförsvaret som också innehåller granula vars innehåll kan utsöndras i en inflammationsprocess.

• author: Rosén, Hanna
• supervisor: Inge Olsson
• opponent: Docent Rasmusson, Birgitta, Linköping University, Sweden
• organization: Division of Hematology and Transfusion Medicine
• publishing date: 2006
• type: Thesis
• publication status: published
• subject: Hematology
• keywords: Hematologi, extracellulära vätskor, Haematology, extracellular fluids, haematopoietic cells, Medicin (människa och djur), Medicine (human and vertebrates), secretory lysosomes, protein targeting
• in: Lund University Faculty of Medicine Doctoral Dissertation Series
• volume: 2006:69
• pages: 137 pages
• defense location: Segerfalksalen, Wallenberg Neurocentrum
• defense date: 2006-05-24 13:00:00
• ISSN: 1652-8220
• ISBN: 91-85481-94-7
• language: English
• LU publication?: yes
• additional info: Hanna Rosén, Ying Gao, Ellinor Johnsson and Inge Olsson. 2003. Artificially controlled aggregation of proteins and targeting in hematopoietic cells. Journal of Leukocyte Biology, vol 74 pp 800-809.; Hanna Rosén, Linda Källquist and Inge Olsson. . Neutrophil pro-elastase sorting involving the plasma membrane is conformation dependent. (manuscript); Hanna Rosén, Jero Calafat, Lars Holmberg and Inge Olsson. 2004. Sorting of Von Willebrand factor to lysosome-related granules of haematopoietic cells. Biochemical and Biophysical Research Communications, vol 315 pp 671-678.; Ying Gao, Hanna Rosén, Ellinor Johnsson, Jero Calafat, Hans Tapper and Inge Olsson. 2003. Sorting of soluble TNF-receptor for granule storage in hematopoietic cells as a principle for targeting of selected proteins to inflamed sites. Blood, vol 102 pp 682-688.
• id: b65c21d7-3215-4c89-a62d-4464a42bf122 (old id 546749)
• date added to LUP: 2016-04-01 15:22:14
• date last changed: 2019-05-22 01:49:02