Interactions of Anticancer Active Platinum(II) Complexes with DNA

Abstract

The kinetics and mechanism for interactions of the anticancer active platinum(II) complexes cis-[PtCl2(NH3)2)], cis-[PtCl2(NH3)(c-C6H11NH2)], and trans-[PtCl2-(NH3)(quinoline)] with DNA have been studied using a combination of HPLC, circular dichroism (CD), UV/vis spectroscopy, and differential scanning calorimetry (DSC). Reactions of the monoaqua forms (charge = +1) of these complexes with single-stranded DNA oligonucleotides, typically between 13-17 bases long, were found to depend on i) the composition of the reaction medium, ii) the exact nature and location of the platination target, and iii) on the DNA structure. The platination reactions were studied in the presence of Na+, Mg2+ and spermidine (spd3+) cations. Increasing concentrations and increasing charge of these electrolytes reduce the rate of platination significantly. The results suggest that the rate dependence on cation concentration occurs as a result of the polyanionic nature of the oligonucleotides, rather than variations of the oligomer structure. Analyses of the kinetic data as a function of the salt dependence suggest that reactions between charged platinum(II) complexes and mononucleotides, for example dGMP or the sulfur-containing nucleotides 4-thiouridine, s4-UMP, and 6-thioinosine, s6IMP, can be described using Brønsted-Debye-Hückel theory. In contrast, paltination reactions of oligonucleotides are better described using polyelectrolyte theory. Results from analyses according to the polyelectrolyte theory suggest that the platinum complex associates with the oligonucleotide during displacement of counter ions from its surface. The associated platinum complex diffuses in reduced dimensions along the oligonucleotide, thus increasing the probability of finding the preferred coordination site. The location dependent kinetics for the oligonucleotides d(Tnp(S)T16-n), where n = 1, 4, 8, 12, and 15, was investigated. The rate of platination is most rapid in the middle of the oligonucleotide, and the reactivity gradually decreases towards both ends, as a consequence of the variation of the charge density along the oligonucleotide. This location dependent kinetics is maximised at low salt concentration, and an increase of the concentration of salt and/or the charge of the electrolytes diminishes the variation in reactivity. Platination in the presence of spd3+ changes the mechanism to one that involves a direct attack of the target on the oligonucleotide. The hairpins are preferentially platinated in the most solvent accessible loop region. As a result the platinated structure destabilizes and the DNA structure changes. The last observation is particularly interesting considering the function of transient DNA hairpins as regulatory factors during gene expression.

Abstract (Swedish)

Popular Abstract in Swedish

I dag används cellhämmande medel, cytostatika, ofta i kombination med andra metoder för behandling av vissa typer av cancer. Cytostatika kan bota t.ex. leukemi, testikel- och lymfkörtelcancer, eller lindra symtomen och förlänga livet vid t.ex. småcellig lungcancer. En grupp av cytostatika utgörs av metallkomplex där metallen är platina (Pt). Upptäckten av en sådan förening kan tillskrivas en amerikansk forskare vid namn Barnett Rosenberg, som i slutet av 1960-talet upptäckte att en platinaatom omgiven av ammoniak- (NH3) och klorid- (Cl-) ligander, har en hämmande effekt på tillväxt av vissa cancerceller (maligna). Den först upptäckta och mest använda föreningen är cisplatin (cis-[PtCl2(NH3)2]), vilken ges som ett cellhämmande medel t.ex. genom preparatet Platinol. Andra platinabaserade cytostatikaföreningar är karboplatin (cis-[Pt(NH3)2(cbdca)], cbdca = 1,1-cyklobutandikarboxylat) samt oxaliplatin (cis-[Pt(oxalat)(dach)], dach = 1,2-diamincyklohexan), vilka ges som preparaten paraplatin respektive eloxatin. Tidigare undersökningar stöder att det är DNA (deoxyribonukleinsyra) som är huvudmålet för platinabaserad cytostatika. Platinakomplexen interagerar med DNA och korsbinder till två baser, företrädelsevis till två GG-baser, genom att substituera båda kloridliganderna. Inbindningen förändrar DNA-molekylens struktur och DNA-syntesen avbryts, vilket leder till cytotoxisk och antitumoral effekt. De sätt på vilka platinakomplexen ?väljer ut? DNA, framför andra potentiella inbindningsställen i cellen, samt vad som sker då platinakomplexen attackerar DNA-molekylen, är i dag inte helt kända. Syftet med avhandlingen är att öka förståelsen för dessa mekanismer. Detta gjordes genom att studera kinetiken för reaktionerna mellan olika platinakomplex och DNA, d.v.s. hastigheten för reaktionerna, samt hur olika faktorer påverkar mekanismen. För att förenkla studien av reaktionerna användes korta enkelsträngar av DNA (oligonukleotider). Dessa uppvisar egenskaper liknande de hos dubbelsträngat DNA. Eftersom platinakomplexen företrädesvis binder till kväve i t.ex. guaninbasen och till svavelinnehållande grupper t.ex. fosfortioatgrupp (p(S)), svavelinnehållande baser 4-tiouridin (s4U) och 6-merkaptoinosin (s6I), men inte till tyminbasen kunde oligonukleotider med endast ett potentiellt inbindningsställe fås på ett enkelt sätt t.ex. d(T6GT6). På så vis kunde vi undersöka hur kinetiken påverkades av inbindningsställets läge på oligonukleotiden. Fosfortioatinnehållande oligonukleotider används inom antisensområdet (kontroll av bildandet av proteiner), s4U förekommer naturligt i Escherichia coli (E-coli) tRNA och s6I används vid behandlingen av leukemi. Vidare användes tre olika anticancer-aktiva platinakomplex: cis-[PtCl2(NH3)2], cis-[PtCl2(NH3)(c-C6H11NH2)] och trans-[PtCl2(NH3)(kinolin)], se figur 3.3. För att underlätta utvärderingen av de kinetiska mätningarna användes respektive monoakvakomplex, t.ex. cis-[PtCl(NH3)2(OH2)]+. På så vis begränsades möjliga reaktioner till direkt substitution av vattenliganden mot ett kväve i G eller ett svavel i p(S), s4U eller s6I. De viktigaste resultaten är:



Den hastighet med vilken platinakomplexen binder in till oligonukleotiderna påverkas starkt av elektrostatiska krafter som verkar mellan molekylerna. Den stora negativa laddningen hos oligonukleotiden medför att platinakomplexet ansamlas vid dess yta, och sedan dras mot mitten där laddningen är som störst. Resultatet är dels högre reaktivitet jämfört med reaktioner med endast inbindningsstället, i frånvaro av omgivande nukleotider, och dels att reaktiviteten är högst vid mitten av oligonukleotiden, för att avta ju längre ut mot ändarna som inbindningsstället är lokaliserat.



Som en konsekvens av att platinakomplexet ansamlas vid ytan av oligonukleotiden påverkas också reaktiviteten starkt av koncentrationen av andra katjoner i reaktionslösningen. Ökad koncentration av dessa katjoner leder till en signifikant minskning av reaktionshastigheten. Detta katjonsberoende utvärderades m.hj.a. olika modeller, och resultatet tyder på att interaktionen mellan platinakomplexen och oligonukleotiderna i stora drag kan förklaras med polyelektrolytteorin.



Platinakomplexens inbindningshastighet påverkades också av de övriga katjonernas laddning och struktur. En högre laddning och formbarhet, var för sig eller tillsammans, minskar hastigheten genom att katjonerna binder in starkare till oligonukleotiden. Vid tillräckligt hög laddning och koncentration kan även oligonukleotidens struktur förändras. Reaktiviteten minskar dramatiskt och mekanismen ändras jämfört med situationen då endast enkelladdade katjoner finns närvarande.



Platinakomplexens inbindingshastighet beror på tillgängligheten av inbindingsstället. En ökad tillgänglighet leder till en ökad reaktivitet. Detta illustreras av reaktionerna med de oligonukleotider som kan bilda en sk. hårpinne. En hårpinne består av en del som är dubbelsträngad, och en del som är enkelsträngad i form av en loop. Den dubbelsträngade delens struktur är relativt stabil, medan loopen är flexibel och mer tillgänglig. Vidare är den negativa elektrostatiska potentialen störst vid den dubbelsträngade delen, vilket medför att de positivt laddade platinakomplexen företrädesvis attraheras dit. Trots detta iakttogs primär inbindning till loopen. Detta tyder på att den ökade tillgängligheten vid loopen är av stor betydelse för platinakomplexens inbindning. Som ett resultat av inbindningen ändrades strukturen och stabiliteten hos hårpinnen. Detta är speciellt intressant då hårpinnestrukturer förekommer rikligt i cellen, där de fungerar som igenkänningsställen för proteiner.

• author: Kjellström, Johan
• supervisor: [unknown] [unknown]
• opponent: Prof Cusumano, Matteo, Dip. di Chimica Inorganica Chimica Analitica e Chimica Fisica, University of Messina, Italy
• organization: Breastcancer-genetics
• publishing date: 2001
• type: Thesis
• publication status: published
• subject: Inorganic Chemistry
• keywords: Inorganic chemistry, polyelectrolyte, medium effects, salt dependence, DSC, CD, HPLC, oligonucleotide, hairpin, DNA, anticancer active platinum(II) compounds, kinetics, mechanism, Oorganisk kemi, Cytology, oncology, cancerology, Cytologi, onkologi, cancer
• pages: 132 pages
• defense location: Sal D, Chemical Center
• defense date: 2001-12-06 10:15:00
• ISBN: 91-628-5056-3
• language: English
• LU publication?: yes
• additional info: The information about affiliations in this record was updated in December 2015. The record was previously connected to the following departments: Inorganic chemistry (ceased) (LUR000010), Oncology, MV (013035000)
• id: 5948bc22-a483-4365-8cb9-571be7a1744c (old id 42138)
• date added to LUP: 2016-04-04 10:29:25
• date last changed: 2018-11-21 20:59:03