Development of adenoviral vectors for monitoring telomerase activity in living cells

Abstract

ABSTRACT



Telomerase activity is a potential molecular marker for cancer and primitive cells in regenerative tissues. The most commonly used method to measure telomerase activity in cells is the telomerase reverse amplification protocol (TRAP) assay, where the protein extracts derived from homogenized cells are analysed. In this thesis we focused on developing a method where telomerase activity could be monitored and used to separating cells with high telomerase activity without killing them. We used the promoter sequence of human telomerase reverse transcriptase (hTERT) for transcriptionally controlling a destabilised green fluorescence protein (d2EGFP) reporter gene since there is a strong correlation between hTERT transcriptional activity and telomerase activity in cells. Moreover, we chose to work with adenoviral vectors due to their high level of transient gene expression as a gene transfer system. Unfavourably, adenoviral vector transduction of tumour cells has been hampered by low expression of the coxsackie B and adenovirus receptor (CAR) on the host cells, which is the attachment receptor for the most commonly used adenoviral vector (Ad5). Thus, we used a fibre-modified Ad5 vector with the tropism of Ad35, which uses the ubiquitously expressed CD46 protein as attachment receptor. We transduced a variety of cell lines with the developed hTERT-d2EGFP vector and demonstrated a close correlation between expression levels of the d2EGFP, endogenous telomerase activity, and hTERT mRNA expression. Furthermore, the hTERT-d2EGFP reporter vector was able to monitor the cell cycle and differentiation stage-dependent hTERT transcription activity.



Additionally, in order to study the self-renewal process of haematopoietic stem cells (HSCs), we utilised the hTERT-reporter vector for monitoring hTERT transcription activity in human HSCs. Interestingly, increasing hTERT expression was inversely correlated to the self-renewal capacity among primitive HSCs and the hTERT-reporter vector could be used to separate short-term from long-term re-populating human HSCs. In summary, we have developed a versatile adenoviral vector system with Ad35 tropism, which can be used to transiently transduce tumour cells as well as haematopoietic cells. This vector system can be used to study normal regulation of hTERT and has potential in development of novel therapeutic approaches for treatment of tumours and malignancies in the blood system.

Abstract (Swedish)

Popular Abstract in Swedish

POPULÄRVETENSKAPLIG SAMMANFATTNING PÅ SVENSKA



Vår arvsmassa finn's lagrad som linjära dubbelsträngade DNA-molekyler, kromosomer, i våra celler. Celler i vävnader och organ förnya's ständigt genom celldelning. Kromosomerna i en cell måste replikera's för att kunna ge upphov till två nya celler. Replikeringsmaskineriet har bara förmågan att arbeta i en riktning läng's med DNA-strängarna och kräver en kort sekven's utav RNA att starta ifrån. Konsekvensen blir att i var ände av kromosomerna är det en av DNA-strängarna som inte kan replikera's till fullo och vid varje celldelning går därför en bit DNA förlorad. Den här ständiga DNA förlusten kalla's för ?änd-replikeringsproblemet? och skulle snabbt få förödande konsekvenser för cellen och vår arvsmassa. Lösningen på problemet är att varje kromosomände består av många kopior av en kort DNA-sekven's som inte utgör någon kodande information och denna sekven's kalla's för telomer. För att vår arvsmassa inte skall ta skada även om telomererna blir farligt korta avstannar celldelningsprocessen, vilket medverkar till åldrandet av vävnader och organ. Vissa celler i kroppen har förmågan till ständig celldelning, bland annat blodstamcellerna som förser kroppen med nya blodceller livet ut. För att bibehålla längden på telomererna i dessa celler uttryck's ett enzym som kalla's för telomera's, var's uppgift är att förlänga telomererna genom att addera fler kopior av den korta DNA-sekvensen till varje kromosomände. Även cancerceller som anse's ha en oändlig och okontrollerad celldelningskaraktär måste behålla telomererna's längd och uttrycker därför oftast telomera's i höga koncentrationer. Sålede's är telomera's en mycket lovande markör för att upptäcka cancerceller och är även ett eventuellt mål för cancerterapi.



Huvudsyftet med avhandlingsarbetet var att utveckla adenovirala vektorer med förmågan att upptäcka uttrycket av telomera's i cancerceller. Fördelen med att använda ett vektorsytem baserat på adenoviru's är många, bland annat är det ett dubbelsträngat DNA-viru's som väldigt sällan integrera's i värdcellen's arvsmassa och kan infektera delande så väl som icke-delande celler. Vi har använt os's av en kontrollregion, en promotor, som vanligtvi's styr genuttrycket utav en huvudkomponent av telomerasenzymet. I vektorerna styr denna promotorn istället uttrycket av en reportergen var's produkt är ett grönt fluorescerande protein. Dessutom är ett ytprotein i vektorn genetiskt modifierat för att vektorn ska infektera cancerceller och blodceller effektivare via en alternativ receptor på cellytan. Detta innebär att om de celler som vanligtvi's uttrycker telomera's infektera's med vektorn kommer det gröna fluorescerande proteinet att producera's och vi kan hitta dessa celler och sortera ut dem. Med hjälp av denna vektorn har vi på cellnivå undersökt telomera's aktiviteten i cancerceller och konstaterat att uttrycket av telomera's är cellcykel- och differentiering's beroende. Den här vektorn använde vi även för att undersöka uttrycket av telomera's ho's blodstamceller. Vi kunde visa att de humana blodstamceller som har ett högt uttryck av telomera's även delvi's har förlorat sin självförnyande förmåga och blivit mer mogna. Denna vektorn ger os's potentiella möjligheter att kunna separera de mest primitiva blodstamcellerna från de mer mogna för att kunna genomföra vidare studier. Sammanfattningsvi's har vi i detta avhandlingsarbete utvecklat adenovirala vektorer som ger os's möjlighet att studera reglering av telomerasuttrycket i normala celler, cancerceller och blodstamceller.

• author: Edqvist, Anna
• supervisor: Bengt Widegren; Xiaolong Fan
• opponent: Docent Essand, Magnus, Uppsala Universitet
• organization: Neurosurgery
• publishing date: 2007
• type: Thesis
• publication status: published
• subject: Biological Sciences
• keywords: cytogenetics, Genetics, cancer, onkologi, Cytologi, cancerology, oncology, Cytology, GBM, HSC, adenovirus, hTERT, Genetik, cytogenetik
• pages: 61 pages
• defense location: Genetikhusets föreläsningssal, Sölvegatan 29, Lund
• defense date: 2007-10-23 09:00:00
• ISBN: 978-91-85067-35-0
• language: English
• LU publication?: yes
• additional info: The information about affiliations in this record was updated in December 2015. The record was previously connected to the following departments: Department of Cell and Organism Biology (Closed 2011.) (011002100), Neurosurgery (013026000)
• id: 510a9170-57a4-404d-b29d-fc040e9e6f65 (old id 599182)
• date added to LUP: 2016-04-04 12:10:11
• date last changed: 2023-04-18 18:18:46