Acoustic Forces in Cytometry and Biomedical Applications: Multidimensional Acoustophoresis

Abstract

Over the last decades the ongoing work in the fields of Lab-on-a-Chip and Micro-Total-Analysis-Systems has led to the discovery of new or improved ways to handle and analyse small volumes of biofluids and complex biosuspensions. The benefits of working on the microscale include: miniaturization of the analysis systems with less need for large sample volumes; temporal and spatial control of suspended particle/cell positions; low volume sheath flow lamination or mixing; novel separation techniques by using forces inherent to the microscale domain; precise regulation of sample temperatures and rapid analysis with less volumes needed to be processed. Researchers now seek to implement these techniques in integrated systems to benefit the biomedical research field as well as clinics.



Acoustophoresis, a method that utilizes acoustic forces to move particles and cells in microfluidic channels has been gaining increased attention over the last decade. The acoustophoretic method has been shown to handle a number of biosuspensions e.g., blood, cell cultures and raw milk as well as other biofluids, and comes with a variety of available unit operations e.g., free flow separation, binary density separation, particle positioning, contactless trapping, buffer changes, washing, and surface chemistry based sorting that allows integration into a wide range of application. The theoretical and experimental understanding of the acoustic radiation force which is the principal force used to manipulate particles in these systems (often generated with standing waves) has also evolved during this time. Chip-based acoustic systems have been presented in e.g., silicon, glass and PDMS, further illustrating the versatility of the method.



This dissertation presents some of the recent developments in the acoustophoretic field to illustrate how acoustic forces can be used in cytometry and biomedical applications, specifically by utilizing multiple acoustic wavelength geometries or two-dimensional particle manipulation. Paper I presents a novel way to pretreat raw milk in order to facilitate rapid quality control. Paper II extends this method by presenting a technique for label free cytometry in raw milk. Paper III showcases the ability to sort particles with fluorescence activated acoustic forces. Paper IV presents a low complexity high precision proof-of-concept sheathless impedance cytometer that can be integrated in other chip based systems. Paper V presents an improved method for concurrent blood component fractionation that requires less manual handling compared to established methods by implementing free flow separation into multiple outlets.



The theory section explains the underlying physical laws that govern the microscale fluid systems presented here. Acoustic force theory is explained in detail for better understanding of the acoustic radiation forces that act on the suspended particles and also cause media streaming. The particle manipulation section compares the different methods that are available to researchers in the biomedical microfluidic field. The microfabrication section deals with the design aspects of using various materials. Unit operations and applications specific for acoustophoresis are presented. Biofluids and cell types including blood and raw milk are discussed to underline the challenges that researchers are faced with during system design, handling and analysis. The aim of this dissertation is to provide a foundation for future development of acoustic force applications in cytometry and biomedicine.

Abstract (Swedish)

Popular Abstract in Swedish

Vilken musiksmak har blodceller?



Forskningen som presenteras i denna avhandling undersöker och drar nytta av hur olika celler uppför sig när de utsätts för ljud. På samma sätt som människor uppskattar olika sorters musik så reagerar olika typer av celler annorlunda beroende på vilka ljud de utsätts för. Cellerna är dessutom ganska konservativa. När de utsätts för ett visst ljud så dansar eller rör de därför på sig på ett väldigt förutsägbart sätt.



Varför har jag då ägnat flera år åt att forska på hur celler reagerar på ljud? Jo, eftersom cellerna är väldigt små kan de fås att röra på sig i väldigt små utrymmen. Detta underlättar i sin tur för mig i min forskning som går ut på att förflytta celler med hjälp av ljudkrafter med målet att förbättra och förminska system som används för cellsortering eller analys. Metoden kallas akustofores.



Jag har bland annat utvecklat ett sorteringschip som kan minska den tid det tar att sortera och sedan analysera olika typer av blodceller var för sig. Ofta sorteras blodet i stora centrifuger på sjukhusens laboratorier. Innan centrifugeringen kan ske måste dock blodprovet förbehandlas och efter centrifugeringen krävs det fingerfärdig personal för att plocka ut rätt sorts celler. I mitt sorteringschip, som inte är större än en femkrona, går det att sortera olika typer av blodceller från varandra med bättre resultat än de stora centrifugerna utan att det går åt en massa manuell arbetstid.



I avhandlingen visar jag även hur det går att förbättra analysmetoder inom livsmedelsindustrin. Jag presenterar ett mikrochip där celler och fett i mjölk separaras med akustofores vilket gör det möjligt att miniatyrisera de redskap som används för kvalitetskontroll av mjölk. Istället för att mjölkbonden ska behöva vänta på resultat från mejeriernas stora mjölkanalysinstrument så kan hen själv kontrollera mjölken på gården och direkt få reda på om en viss ko till exempel blivit sjuk. På så vis får inte bara kon snabbare behandling utan bonden slipper också ge antibiotika till de andra korna helt i onödan. Således kan vi minska mängden antibiotika i den mjölk vi ska dricka, korna blir friska snabbare och bonden sparar pengar. Samtidigt minskas användandet av både antibiotika och onaturliga fettlösningsmedel inom mejeriindustrin.



För att ytterligare kunna förminska analysinstrumenten så har jag även utvecklat ett litet chip som inte bara sorterar cellerna utan även analyserar dem direkt. Tekniken går ut på att mäta cellernas storlek eller se vilken typ av celler det är med hjälp av svaga elektriska strömmar. Normalt sett krävs det avancerade elektrodlösningar för att kunna utföra elektrisk cellanalys (impedansspektroskopi) med hög noggrannhet. I mikrochippet används ljudkrafter för att placera cellerna på en bestämd plats i chippet vilket gör det möjligt att använda enkla elektrodkonfigurationer för att analysera dem. I likhet med resten av forskningen jag presenterar så gör även detta chip det möjligt att utveckla små, billiga eller handburna instrument.



Resultaten av min forskning är viktiga eftersom de gör det enklare och billigare för samhället att upptäcka sjukdomar eller genomföra grundläggande forskning på olika celltyper. Det är dock inte bara Sverige eller andra länder med välutvecklad infrastruktur för hälsovård eller livsmedelkontroll som kan dra nytta av mina forskningsresultat. I Kina ökar till exempel mjölkdrickandet kraftigt samtidigt som det inte finns några bra rutiner för kvalitetskontroll och i Indien där det både produceras och dricks mest mjölk i världen har inte alla råd med bra analysinstrument. Genom att göra det möjligt för bönder och statliga verk i dessa länder att få tillgång till billiga handburna ”point-of-care” instrument kan min teknik göra stor nytta.



Billiga ”point-of-care” instrument är även till stor nytta för hälsovårdsarbetare i fattiga länder. De skulle kunna använda handburna medicinska instrument för att upptäcka och behandla sjukdomar på landsbygden och på så sätt förhindra spridning av epedemier. Med det miniatyriserade blodsorteringsinstrumentet som jag presenterar här skulle man till exempel kunna mäta förhållandet mellan olika vita blodkroppar i ett blodprov och på så sätt kanske avgöra om en patient lider av HIV eller andra sjukdomar.



Bakgrunden till att vi på institutionen för Biomedicinsk Teknik vid Lunds universitet bedriver denna typ av forskning är att vi sedan flera årtionden har forskat på ljudets egenskaper och vidareutvecklat de apparater som krävs för att alstra och använda ljud i olika applikationer, med speciell inriktning på ultraljud, dvs ljud med frekvenser över 20 000 Hz. Inom ramen för forskningen på vår institution utvecklades under 1950- och 60-talet det medicinska ultraljudet som idag är en av de viktigaste diagnostikmetoderna på sjukhus världen över. Den som bedrev denna forskning i Lund var Hellmuth Hertz, den första professorn på vår institution. Det medicinska ultraljudet alstras med hjälp av kristaller som vibrerar i hög frekvens. Hellmuth Hertz använde senare samma sorts kristaller för att stabilisera droppbildningen i de första bläckstråleskrivarna.



Arbetet med medicinska applikationer för ultraljud har fortsatt på institutionen och nyligen presenterade vi en metod för att detektera cirkulerande tumörceller som bygger på samma teknik som jag använder i den här avhandligen. Inom cancerforskningen har det på senare år visat sig att dessa celler kan indikera att en cancertumör har spridit sig. Genom att upptäcka de cirkulerande tumörcellerna kan man då i ett tidigt skede sätta in rätt sorts behandling för patienten. Eftersom metoden inte bara möjliggör små utan även relativt billiga analysinstrument hoppas vi att den ska leda till att fler kontroller genomförs och således minska antalet patienter som inte får rätt behandling från början.



Den typ av kristaller som Hellmuth Hertz använde när han uppfann det medicinska ultraljudet använder jag idag för att alstra de ultraljudskrafter som genom akustofores sorterar och flyttar cellerna till olika positioner i mina mikrochip. Genom att dra nytta av de senaste årtiondenas framsteg inom mikrofabrikation kan jag tillverka små flödeskanaler i mikrochippen där cellerna i till exempel mjölk, vatten eller blod kan adresseras till olika utlopp eller positioner. Ljudvågor breder ut sig genom tryckvariationer. Det är dessa tryckvariationer som får oss att höra ljud genom att trumhinnan rör på sig när den utsätts för tryckvariationen i ljudvågen. På samma sätt använder jag krafterna som alstras av tryckvariationerna i mina flödeskanaler för att röra på celler och andra små partiklar. Genom att fästa vibrerande piezokeramiska kristaller på mikrochippet kan ljudet ledas in i flödeskanalen. Genom att anpassa ljudfrekvensen (oftast runt 2 MHz) till flödeskanalerns storlek kan jag sedan skapa stående ultraljudsvågor, dvs ljudekon som studsar från vägg till vägg, eller mellan tak och botten i kanalerna, utan att tappa nämnvärt mycket energi. De stående vågorna orsakar en dramatisk ökning av ljudkrafterna inne i kanalen vilket gör det möjligt att snabbt flytta cellerna till bestämda positioner i flödeskanalen. Ljudkraften påverkar cellerna olika beroende på deras storlek, densitet och kompressibilitet. Genom att anpassa ljudkrafterna och kanalernas utformning efter olika celltyper kan jag sedan sortera dem från varandra eller fokusera dem i väldigt exakta positioner i kanalen.



Hur var det då med blodcellernas musiksmak? Jo, i en 375 mikrometer bred kanal blir det full fart på dem när de utsätts för musik i form av 2 MHz ultraljud.

• author: Grenvall, Carl
• supervisor: Thomas Laurell
• opponent: Dr, Assoc. Prof. Graves, Steven, University of New Mexico, Center for Biomedical Engineering, Albuquerque N.M., USA
• organization: Department of Biomedical Engineering
• publishing date: 2014
• type: Thesis
• publication status: published
• subject: Medical Engineering
• keywords: Acoustophoresis, Microfluidics, Ultrasound, Multinode, Cell Sorting, Particle Positioning, Cytometry, Lab-on-a-Chip, µTAS, Binary Separation, Acoustic Barriers, Acoustic Particle Manipulation, Acoustic Standing Waves, Blood Separation, Milk Analysis
• in: ISRN: LUTEDX/TEEM – 1096 – SE Report: 3/14
• pages: 120 pages
• defense location: Lecture hall E:1406, E-building, Ole Römers väg 3, Lund University, Faculty of Engineering, LTH
• defense date: 2014-12-05 10:15:00
• ISBN: 978-91-7623-194-4 (print)
• ISBN: 978-91-7623-195-1 (pdf)
• language: English
• LU publication?: yes
• id: 5c5d54ba-05a9-4d2b-bcea-9dc00476b9ff (old id 4778297)
• date added to LUP: 2016-04-04 10:58:15
• date last changed: 2019-05-21 14:54:41