Advanced

Regulation of Aquaporins by Proteins, Metal ions and Phosphate groups

Kreida, Stefan LU (2019)
Abstract (Swedish)
Livets minsta byggstenar är celler (från latinets cella; litet rum). Hos encelliga djur, t. ex bakterier och jäst innehåller de enskilda cellerna allt som behövs för att leva och föröka sig. Hos flercelliga organismer är cellerna specialiserade och bygger tillsammans med andra specialiserade celler upp vävnader, organ och hela organismer. Gemensamt för alla celler är att de utvändigt omsluts av ett plasmamembran. Detta membran är uppbyggt av fettmolekyler, så kallade lipider, och utgör cellens yttre gräns. Membranet innehåller också receptorer som känner av omgivningen och skicka signaler inåt och allt som ska in i cellen måste på något sätt passera det. För molekyler som är vattenlösliga är det svårt att passera ett plasmamembran, varför... (More)
Livets minsta byggstenar är celler (från latinets cella; litet rum). Hos encelliga djur, t. ex bakterier och jäst innehåller de enskilda cellerna allt som behövs för att leva och föröka sig. Hos flercelliga organismer är cellerna specialiserade och bygger tillsammans med andra specialiserade celler upp vävnader, organ och hela organismer. Gemensamt för alla celler är att de utvändigt omsluts av ett plasmamembran. Detta membran är uppbyggt av fettmolekyler, så kallade lipider, och utgör cellens yttre gräns. Membranet innehåller också receptorer som känner av omgivningen och skicka signaler inåt och allt som ska in i cellen måste på något sätt passera det. För molekyler som är vattenlösliga är det svårt att passera ett plasmamembran, varför detta sker genom kanaler eller pumpar som perforerar membranet och med stor specificitet låter vissa molekyler passera igenom. Dessa receptorer, kanaler och pumpar utgörs av membranproteiner som sitter inbäddade i plasmamembranets lager av lipider.
Vatten är förutsättningen för allt liv på jorden men även vatten måste kunna ta sig in och ut ur celler. Detta sker med hjälp av specialiserade vattenkanaler, så kallade aquaporiner. Dessa membranproteiner finns i de flesta organismer och hos människor är de utspridda på många ställen i kroppen. De har ofta specifika roller i organ och vävnader där det passerar stora mängder vatten. Den forskning som presenteras i den här avhandlingen handlar om hur två närbesläktade aquaporiner: aquaporin 0, som finns i ögats lins; och aquaporin 2, som finns i njurarna, aktiveras och deaktiveras (regleras). I båda fallen vet man att andra proteiner är inblandade.
Aquaporin 0 regleras genom att det lilla proteinet calmodulin binder till det och blockerar vattenporen. Aquaporin 2 binder istället ett annat protein, LIP5 vilket gör att aquaporinet skickas in i cellens inre, bort från plasmamembranet. Man säger att aquaporin 2 regleras genom "trafficking" medan aquaporin 0 regleras genom "gating". De två aquaporinerna är viktiga för kroppen och om de inte regleras på rätt sätt leder det till sjukdomar. När aquaporin 2 inte fungerar i njurarna får man kronisk vattenbrist (Nefrogen diabetes insipidus, NDI) som kommer av att njurarna inte kan koncentrera urinen tillräckligt eftersom aquaporin 2 inte finns i rätt mängd i plasmamembranet. Ögats lins kan ändra form för att fokusera ljus och detta sker genom att den tar in ut vatten och då aquaporin 0 inte fungerar bryts linsen ned.
Båda dessa aquaporiner fosforyleras på specifika ställen och bara under specifika omständigheter. Detta innebär att fosfatgrupper enzymatiskt sätts på aquaporinerna. Fosforylering är ett mycket vanligt sätt att ändra ett proteins egenskaper och fungerar som en slags kod som läses av andra proteiner. För aquaporin 2 vet man at fosforylering sker på fyra platser: S256, S261, S264 och T269 och var det hamnar i cellen beroende på vilken av dem som fosforyleras. Aquaporin 0 fosforyleras på S229, S231 och S235 och man vet genom att studera celler att dessa påverkar öppningen och stängningen av kanalen. Intressant nog sker denna fosforylering på både aquaporin 0 och aquaporin 2 på samma stället som de interagerar med de reglerande proteinerna calmodulin och LIP5. Frågeställningen i den här avhandlingen handlar om att förstå hur fosforyleringskoden påverkar aquaporin 0 och aquaporin 2 och deras förmåga att interagera med calmodulin och LIP5. Vi tittar också på hur zink, som det finns mycket av i ögat, påverkar interaktionen mellan aquaporin 0 och calmodulin.
Resultaten visar att aquaporin 2 interagerar starkast med LIP5 då det är ofosforylerat eller då S264 är fosforylerat. Vi vet sedan tidigare att LIP5 har en roll i att sortera proteiner och resultaten visar att den bara kan sortera aquaporin 2 då det är ofosforylerat eller då just S264 är fosforylerat. Fosforylering av de andra aminosyrorna är med andra ord en signal som förhindrar det. För Aquaporin 0 visar resultaten att fosforylering av S229 och S235 gör att calmodulin inte kan binda, vilket leder till att poren inte blockeras. Fosforylering av S231 gör att aquaporin 0 fortfarande kan binda calmodulin men då förblir poren öppen. Dessa resultat illustrerar hur komplex och mångfacetterad fosforyleringkoden är. Genom proteomanalys av linsen vet man aquaporin 0 blir mer fosforylerat på S235 ju längre in i linsen man kommer. Våra resultat tyder alltså på att aquaporin 0 (som för övrigt utgör 50% av alla membranproteiner i linsen) slutar regleras av calmodulin ju närmare linsens mitt man kommer samt att den bara kan regleras av calmodulin då den inte är fosforylerad. Resultaten visar också att zink kan binda till calmodulin, som då skiftar form och interagerar med aquaporin 0 på att annat sätt. Mer forskning krävs för att förstå hur just detta påverkar linsens funktion.
Forsking har visat att en majoritet av alla cellulära proteiner vid något tillfälle fosforyleras. Resultaten här kan tillsammans med andra studier förklara hur denna kod påverkar aquaporin 0 och aquaporin 2. Eftersom fosforylering är en så pass allmän företeelse kan man överföra kunskapen till andra processer. Fler membranproteiner än aquaporin 2 regleras genom "trafficking", genom samma mekanism som med hjälp av LIP5. Våra resultat kan därför hjälpa till att förstå även denna universella regleringsmekanism. För aquaporin 2 finns andra proteiner som är inblandade i trafficking som är värda att undersöka, vilket skulle kunna ge en mer komplett bild av hela kedjan och vara nyckeln till att lösa sjukdomen NDI. För aquaporin 0 vet man ännu inte exakt hur calmodulin gör för att blockera poren, hur och när det sker i linsen och hur det påverkar linsens struktur. Mycket återstår att undersöka i framtiden och jag ser själv mycket fram emot svaren på dessa och ytterligare frågor.
(Less)
Abstract
Aquaporins (AQPs) are membrane-bound intrinsic water channels that allow the passive diffusion of water and small solutes across cellular membranes. There are 13 highly conserved isoforms of these channels in human, which differ in specificity, regulation and localisation in cells and tissues. The work in this thesis focuses on AQP0 and AQP2; water-specific aquaporins that are known to interact with regulatory proteins via their respective C-termini and which both contain multiple phosphorylation sites within this region.

AQP0 is the main aquaporin of the eye lens. It binds calmodulin (CaM); the ubiquitous calcium-sensing protein, and this interaction has been proposed to block the water pore. Using microscale thermophoresis and... (More)
Aquaporins (AQPs) are membrane-bound intrinsic water channels that allow the passive diffusion of water and small solutes across cellular membranes. There are 13 highly conserved isoforms of these channels in human, which differ in specificity, regulation and localisation in cells and tissues. The work in this thesis focuses on AQP0 and AQP2; water-specific aquaporins that are known to interact with regulatory proteins via their respective C-termini and which both contain multiple phosphorylation sites within this region.

AQP0 is the main aquaporin of the eye lens. It binds calmodulin (CaM); the ubiquitous calcium-sensing protein, and this interaction has been proposed to block the water pore. Using microscale thermophoresis and fluorescence anisotropy we characterised the interaction between CaM and AQP0 in different phosphorylation states. Our results show that CaM binds full-length AQP0 with positive cooperativity, which is not seen when AQP0 C-terminal peptides are used. Moreover, the phospho-mimicking mutants AQP0-S229D and S235D blocks binding to CaM, whereas S231D can bind with similar affinity as wild type but in a different way. Functional water conductance assays confirm previous studies that CaM blocks the channel in a calcium-dependent manner whereas all mutants are insensitive to CaM/Ca and locked in an open state. Using a combination of fluorescence anisotropy, chemical crosslinking and small-angle X-ray scattering, we further show that zinc binding induces a conformational change in CaM, thereby affecting its interaction with AQP0. This may be of physiological importance for CaM-mediated regulation of AQP0 in the eye.

AQP2 is regulated by vasopressin-dependent trafficking in the kidney collecting duct, which involves phosphorylation of the AQP2 C-terminus. Here we investigate how phosphorylation affects the interaction with LIP5, an ESCRT-III/Vps4 adaptor protein which plays a role in targeting AQP2 to multivesicular bodies (MVB) and subsequent lysosomal degradation. Our results from far-western blot and MST show that the phospho-mimicking mutants S256E, S261E, T269E and S256E-T269E impair LIP5 binding, whereas S264E does not significantly affect the affinity to LIP5. Removal of all phosphorylation sites through truncation while retaining the LIP5 binding site reduced the affinity further, suggesting that phosphorylation of AQP2 allosterically controls its interaction with LIP5. Our results fit well with the suggested roles of the respective phosphorylation sites in AQP2 trafficking and suggests that LIP5 may have a more direct role in MVB cargo sorting than previously understood.
(Less)
Please use this url to cite or link to this publication:
author
supervisor
opponent
  • Professor Vogel, Hans J., University of Calgary, Canada
organization
publishing date
type
Thesis
publication status
published
subject
keywords
aquaporin-2, aquaporin-0, calmodulin, LIP5, phosphorylation, calcium, zinc, protein-protein interactions, aquaporin regulation, trafficking, gating
pages
76 pages
publisher
Lund University, Faculty of Science, Department of Chemistry
defense location
Sal C, Kemicentrum, Naturvetarvägen 14, Lund
defense date
2019-02-22 09:15
ISBN
978-91-7753-980-3
978-91-7753-981-0
language
English
LU publication?
yes
id
62e9cdba-e732-4ce2-aaef-586227ecc1e5
date added to LUP
2019-01-29 21:59:49
date last changed
2019-02-06 09:56:56
@phdthesis{62e9cdba-e732-4ce2-aaef-586227ecc1e5,
  abstract     = {Aquaporins (AQPs) are membrane-bound intrinsic water channels that allow the passive diffusion of water and small solutes across cellular membranes. There are 13 highly conserved isoforms of these channels in human, which differ in specificity, regulation and localisation in cells and tissues. The work in this thesis focuses on AQP0 and AQP2; water-specific aquaporins that are known to interact with regulatory proteins via their respective C-termini and which both contain multiple phosphorylation sites within this region. <br/><br/>AQP0 is the main aquaporin of the eye lens. It binds calmodulin (CaM); the ubiquitous calcium-sensing protein, and this interaction has been proposed to block the water pore. Using microscale thermophoresis and fluorescence anisotropy we characterised the interaction between CaM and AQP0 in different phosphorylation states. Our results show that CaM binds full-length AQP0 with positive cooperativity, which is not seen when AQP0 C-terminal peptides are used. Moreover, the phospho-mimicking mutants AQP0-S229D and S235D blocks binding to CaM, whereas S231D can bind with similar affinity as wild type but in a different way. Functional water conductance assays confirm previous studies that CaM blocks the channel in a calcium-dependent manner whereas all mutants are insensitive to CaM/Ca and locked in an open state. Using a combination of fluorescence anisotropy, chemical crosslinking and small-angle X-ray scattering, we further show that zinc binding induces a conformational change in CaM, thereby affecting its interaction with AQP0. This may be of physiological importance for CaM-mediated regulation of AQP0 in the eye. <br/><br/>AQP2 is regulated by vasopressin-dependent trafficking in the kidney collecting duct, which involves phosphorylation of the AQP2 C-terminus. Here we investigate how phosphorylation affects the interaction with LIP5, an ESCRT-III/Vps4 adaptor protein which plays a role in targeting AQP2 to multivesicular bodies (MVB) and subsequent lysosomal degradation. Our results from far-western blot and MST show that the phospho-mimicking mutants S256E, S261E, T269E and S256E-T269E impair LIP5 binding, whereas S264E does not significantly affect the affinity to LIP5. Removal of all phosphorylation sites through truncation while retaining the LIP5 binding site reduced the affinity further, suggesting that phosphorylation of AQP2 allosterically controls its interaction with LIP5. Our results fit well with the suggested roles of the respective phosphorylation sites in AQP2 trafficking and suggests that LIP5 may have a more direct role in MVB cargo sorting than previously understood. <br/>},
  author       = {Kreida, Stefan},
  isbn         = {978-91-7753-980-3},
  keyword      = {aquaporin-2, aquaporin-0, calmodulin, LIP5, phosphorylation, calcium, zinc, protein-protein interactions, aquaporin regulation, trafficking, gating},
  language     = {eng},
  pages        = {76},
  publisher    = {Lund University, Faculty of Science, Department of Chemistry},
  school       = {Lund University},
  title        = {Regulation of Aquaporins by Proteins, Metal ions and Phosphate groups},
  year         = {2019},
}