Antibiotic resistance and pathogenesis of Streptococci with focus on Group A Streptococci

Abstract

Multi-drug resistant (MDR) infections remain the leading cause of death worldwide. MDR infections caused by Streptococcus pneumoniae (Spn), Streptococcus pyogenes (GAS) and Streptococcus agalactiae (GBS) are considered global threats to human health due to increased spread of antibiotic resistance and limited treatment options. In this thesis, we present the human milk derived HAMLET (Human Alpha-lactalbumin Made Lethal to Tumor cells) complex as a potential therapeutic alternative against streptococcal infections for its bactericidal and bacteriostatic activity against broth grown streptococci (Spn, GAS, or GBS). Adding to it, HAMLET potentiated antibiotic activity that renders antibiotic-resistant streptococci sensitive to the drugs they are resistant to, regardless of expressed serotype or antibiotic-resistance mechanism (target modification or efflux pumps).

Biofilm formation and intracellular residence are antimicrobial avoidance mechanisms that help GAS escape host- or antibiotic-killing mechanisms. After completed antibiotic treatment against pharyngitis, intracellular bacteria may re-emerge and cause recurrent infections, leading to treatment failure. This thesis aims to identify novel therapeutic targets during respiratory infections by investigating GAS mediated pathogenic mechanisms. As most biofilms were studied on non-representative abiotic surfaces, we used a well-established biofilm model mimicking the respiratory niche to show that biofilm formation on pre-fixed epithelial cells is common in GAS. Proteome analysis of biofilm bacteria helped us identify proteins involved during biofilm formation and show that highly down-regulated protein expression is needed to form highly functional biofilms. In a live cell infection model, we show that biofilm bacteria internalize and persist equally long among GAS strains within epithelial cells. Using these models along with GAS strains lacking or expressing known virulence factors, we identify the role of these factors during biofilm formation and uptake into respiratory epithelial cells by GAS.

Overall, the results obtained here are of clinical importance and could help in finding potential therapeutic strategies targeting streptococci during respiratory infections.

Abstract (Swedish)

Antibiotika-resistens utgör ett ökande hälsoproblem i världen och bakterier blir alltmer resistenta mot de antibiotika vi har att behandla med. Fler bakterier blir också resistenta mot mer än ett antibiotikum och behandling av infektioner med dessa typer av bakterier kompliceras av bristen på effektiva läkemedel vilket leder till ökade sjukvårdskostnader, längre vårdtider och en minskad chans att överleva resistenta infektioner. Ökad spridning av antibiotika-resistens bland streptokocker som Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes och Streptococcus agalactiae, utgör en global fara för människors hälsa. Antibiotika-resistens i dessa bakteriearter sker via ett antal mekanismer bl.a. proteiner som bryter ner antibiotika, utflödespumpar som pumpar ut antibiotika utanför bakterien, strukturändring på bakteriemolekyler som minskar antibiotikas möjlighet att binda och m.m. Det krävs således nya behandlingsalternativ som bakterier inte bildar resistens mot, men då upptäckter och utveckling av nya konventionella läkemedel dröjer är molekyler från naturkällor ett annat alternativ. Ett exempel är bröstmjölk som är känd för sina antibakteriella egenskaper.

I denna avhandling presenterar vi ett protein-komplex som vi tidigare har upptäckt i bröstmjölk och som har förmågan att döda vissa bakteriearter. Komplexet heter HAMLET (Human Alpha-lactalbumin Made Lethal to Tumor cells) och består av proteinet alfa-laktalbumin som binder in fettsyran oleinsyra. Vi visar här att HAMLET-behandling av ovan nämnda streptokocker hämmar deras tillväxt och följaktigt leder till bakteriernas död. Förutom en direkt bakteriedödande effekt har HAMLET visat sig kunna öka aktiviteten av antibiotika mot bakterier som har utvecklat resistens, vilket leder till ökad känslighet mot antibiotikan och slutligen bakteriedöd. Vi visar här att streptokocker också är en bakteriegrupp vars antibiotikaresistens kan påverkas av HAMLET. Kombinationsbehandling av dessa bakteriearter med HAMLET och antibiotika som bakterierna är resistenta mot leder till ökad känslighet av bakterierna mot antibiotikan med resulterande bakteriedöd, oavsett resistensmekanism eller stam typ. Således utgör HAMLET en potentiell form av framtidsbehandling mot streptokockinfektioner.

Vissa bakteriearter skyddar sig från effekten av antibiotika genom att bilda biofilmer (organiserade bakteriesamhällen) när de koloniserar slemhinnor i kroppen eller tar sig in till människoceller (internalisering) och gömmer sig där under långa tidsperioder (persistens). Vi har tidigare sett att Streptococcus pyogenes (även känd som Grupp A Streptokocker, eller GAS) bildar biofilmer när de koloniserar keratinocyter in vitro och på ett okänt sätt tar biofilm-bakterierna in sig i cellerna utan att bli upptäckta eller dödade av cellen. I de flesta fall ses bärarskap utan symtom hos friska individer (5 - 20%), vilket eventuellt förklarar hur bakterierna sprider sig mellan individer. Men ibland orsakar bakterierna infektioner. GAS är en humanspecifik patogen som orsakar lokala (faryngit och ytliga hudinfektioner) såväl som systemiska (köttätande och toxinmedierade) infektioner. Återkommande faryngit är ett hälsoproblem hos barn där GAS-bakterier gömmer sig inuti celler i halsmandlarna, och efter avslutad antibiotika-behandling, kan ta sig ut i svalget där de startar en ny infektion. I vissa fall slutar detta med en kirurgisk procedur där halsmandlarna opereras bort på grund av misslyckad behandling.

Baserat på denna kliniska information avser denna avhandling att förstå GAS-mekanismer under luftvägsinfektioner samt identifiera potentiella faktorer som GAS använder för att initiera dessa infektioner. Med hjälp av vår etablerade biofilmmodell och GAS-mutanter som saknar specifika virulens faktorer, undersökte vi biofilm-bildning i dessa bakterier, analyserade biofilmernas protein-reglering, och identifierade faktorer ansvariga för kolonisering och biofilm-bildning. I en levande infektionsmodell undersökte vi mekanismerna bakom internalisering och persistens av GAS i luftvägsceller och med hjälp av mikroskopering, visualiserade och lokaliserade vi bakteriernas lokalisering inuti celler. Vi kom fram till att upptag av biofilm-bakterier i luftvägsceller är en gemensam mekanism bland GAS-bakterier och att biofilmbakterier stannar lika länge inuti celler, oberoende av stam typ. Med hjälp av mutanterna identifierade vi potentiella faktorer som krävs för internalisering- och persistens-processerna. Generellt är GAS faktorer som är inblandade i kolonisering, biofilm-bildning samt internalisering och persistens inom luftvägsceller möjliga behandlingsmål som kan användas för att utveckla nya strategier för att bota GAS-infektioner.

Erhållna resultat i denna avhandling har klinisk potential. HAMLETs antibakteriella effekter kan användas som en möjlig behandlingsterapi mot streptokockinfektioner. Vi har även undersökt GAS-mekanismer under luftvägsinfektioner samt identifierat inblandade faktorer som kan potentiellt användas som behandlingsmål mot dessa infektioner.

• author: Alamiri, Feiruz
• supervisor: Anders P Håkansson; Kristian Riesbeck
• opponent: professor Norrby-Teglund, Anna, Stockholm
• organization: Experimental Infection Medicine, Malmö (research group)
• publishing date: 2020
• type: Thesis
• publication status: published
• subject: Microbiology in the medical area; Infectious Medicine
• keywords: Antibiotika resistens, Bröstmjölk, Luftvägsinfektioner, Biofilm bildning, Internalisering, Persistens, HAMLET, Streptokocker, kolonisering, Streptococcus pneumoniae, biofilm formation, Internalisation, Persistence, Antibiotic resistance, Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae, HAMLET, Breast milk, Proteome, Virulence factors, Colonization
• in: Lund University, Faculty of Medicine Doctoral Dissertation Series
• issue: 2020:139
• pages: 81 pages
• defense location: Agardh föreläsningssal, CRC, Jan Waldenströms gata 35, Skånes Universitetssjukhus i Malmö
• defense date: 2020-12-18 13:00:00
• ISSN: 1652-8220
• ISBN: 978-91-8021-006-5
• language: English
• LU publication?: yes
• id: 6503ff56-19ac-415f-b359-f1e36d1c1bfd
• date added to LUP: 2020-11-20 16:33:27
• date last changed: 2021-01-03 09:22:00