Bioengineering and Cell-derived Strategies for Salivary Gland Regeneration

Abstract

Xerostomia (dry mouth symptoms) is a group of incurable debilitating conditions of salivary glands caused by aging, radiation/chemical exposure, or aberrant inflammation in the salivary glands. During this PhD thesis, we aimed to evaluate whether cell-derived strategies (e.g., extracellular vesicles, EVs) could be a potential new therapy to ameliorate salivary gland injury and restore function after radiotherapy or in autoimmune diseases. In addition, we aimed to develop new imaging techniques for both 2D and 3D analysis of larger samples which allows for quantification of disease and regenerative features. Firstly, we constructed an in vivo murine model of 25 Gy irradiation-induced salivary gland damage to evaluate the potential of human dental pulp stem cell (hDPSCs)-derived EVs. EVs were injected 3x weekly via tail vein, beginning immediately after irradiation. Salivary gland function was evaluated 18 days after irradiation using salivary gland flow rate (SFR), gene expression (by qRT-PCR) and histopathology. Next, we tested different methods to generate PCSS using a vibratome and evaluated the slices in terms of viability (by WST-1), gene expression (by qRT-PCR), secreted α-amylase activity (by α-amylase assay kit) and histological/light sheet fluorescence microscopy (LSFM) three-dimensional imaging. Following irradiation, SFR decreased while senescence-associated β-galactosidase-positive cells (via immunofluorescences) and senescence-related genes and secretory-phenotypes (e.g., p21 and MMP3 in qRT-PCR) increased. SFR was unchanged following EVs treatment, but senescence-associated genes and secretory-phenotypes decreased. We also demonstrated that in an animal model of Sjögren’s syndrome, which exhibit dry mouth symptoms, that hDPSCs-EVs could inhibit the acquisition of the senescent phenotype in salivary gland epithelial cells (SGECs) and alleviate the loss of glandular function. EVs were also found to perform these effects through an underlying immunomodulatory mechanism. For PCSS, we developed protocols to produce viable slices of controled thicknesses which retained the ability to secrete functional α-amylase for at least two days in ex vivo culture. Phenotypic salivary gland cell epithelial markers (e.g., Keratin 5 and Aquaporin 5) increased over time in PCSS (by qRT-PCR), indicating the retention of cells that are necessary for salivary glands’ function. We developed workflows to perform LSFM 3D visualization in whole salivary glands as well as the PCSS model. In conclusion, hDPSCs-EVs reduced senescence of salivary gland epithelial cells in both murine irradiation and Sjögren’s syndrome models and may become a promising future for xerostomia patients. For the murine PCSS, we successfully established an executable operating procedure at the methodological level to reliably generate viable and functional murine PCSS and developed new state-of-the-art analytical methods (such as LFSM 3D imaging and qRT-PCR) to increase the diversity of objective tools to evaluate PCSS. Therefore, this work laid the foundation for the future application of other therapies (such as irradiation therapy or EVs therapy) to the PCSS model. Those future applications could include drug screening or mechanism of injury study. At the same time, we developed a sustainable histology process to reduce xylene utilization in histological processing for salivary gland tissue processing. Therefore, this work has developed a set of in vitro and in vivo experiments with state-of-the-art methods to better understand disease mechanisms and to evaluate new therapies for salivary glands.

Abstract (Swedish)

Xerostomi, är en kliniskdiagnos för muntorrhet. Muntorrheten kan uppkomma till
följd av åldersförändringar, strålnings- och kemikalieexponering eller en
inflammation i spottkörtlarna. Extracellulära vesiklar (EVs) är små vesiklar (i
nanometerstorlek) vilka normalt används vid cellers kommunikation med varandra.
EVs har visats ha positiv effekt i djurförsök vid skada eller sjukdom i tex lunga,
hjärta, njure mm. Detta avhandlingsarbete fokuserar på att undersöka om EVs, från
celler som även testas inom stamcellsterapier, skulle kunna användas som
behandlingsmetod vid skada på spottkörtlarna eller vid autoimmuna sjukdomar.
Hittills har det inte gjorts många undersökningar kring att använda EVs vid skador
eller sjukdomar som drabbar just spottkörtlarna. Den stora fördelen med att använda EVs framför stamceller är att du inte behöver injicera hela celler i djuret. Att injicera hela celler utgör en risk då cellerna kan bli bortstötta eller riskerar att ge upphov till tumörer. För att testa teorin kring att använda EVs konstruerade vi först en musmodell med en strålningsinducerad skada i spottkörtlarna för att sedan evaluera potentialen i EVs från humana stamceller från pulpan i tänder (human dental pulp stem cell, hDPSC). hDPSC är en möjlig effektiv källa för EVs då de kan utvinnas ganska lätt ur kirurgiskt avfall från de flesta tandläkarkliniker (dvs tänder). Vårt lab har sedan tidigare tagit fram metoder för isolering och karakterisering av EVs från hDPSC. EVs injicerades 3 gånger i veckan via svansvenen på strålade möss, med första injektionen direkt efter strålningen. Spottkörtlarnas funktion undersöktes 18 dagar efter strålningen genom att vi mätte flödeshastigheten av saliv i spottkörtlarna (salivary gland flow rate, SFR), genuttryck (med en kvantitativmetod för genuttryck som kallas qRT-PCR) och vävnadsanalys i mikroskop (dvs histologi). Resultaten visar, som förväntat, att efter strålning minskar SFR, medan celler associerade med åldrande (β-galaktosidaspositiva celler) samt gener och ämnen associerade med åldrande celler (p21 och MMP3) ökade. Åldrande celler är celler som inte längre delar sig, men inte heller dör. Dessa celler utsöndrar ämnen som kan vara skadliga för kringliggande vävnad, denna fenotyp benämns ”senescence associated secretory
phenotype” (SASP). SFR förblev oförändrat låg även efter EV-behandling medan
genuttryck och fenotyp associerat med SASP minskade. Vi visade också i en
djurmodell av Sjögrens syndrom, där patienterna uppvisar symptom av muntorrhet, att hDPSC-EVs kunde förhindra att epitelcellerna i spottkörtlarna utvecklade fenotypen av åldrande celler samt bidrog till att bibehålla en större del av körtelfunktionen. Vi visade även att EVs kan ge dessa effekter genom att påverka immunsystemet. Vi drar därmed slutsatsen att hDPSC-EVs minskar åldrandet av epitelcellerna i spottkörtlarna både i strålningsskadade musmodeller och i modeller av Sjögrens syndrom och därmed utgör en tänkbar kandidat för behandling av patienter som lider av xerostomi.

Då användning av djurförsök kräver många djur var ett andra mål i detta
avhandlingsarbete att ta fram vävnadssnitt, precisionsskurna skivor av spottkörtlar
s.k. precision cut salivary gland slice (PCSS), som en användbar ex vivo modell för
sjukdomsmekanismer i spottkörtlar. PCSS skulle kunna minska antalet djur
drastiskt eftersom det gå att få många vävnadssnitt från ett djur, en spottkörtel kan ge upp till 20 vävnadssnitt. Dessa tekniker kan även användas på mänsklig vävnad (som tex kirurgiskt avfall). Vi började med att prova olika metoder för att producera PCSS med en vibratom och utvärderade vävnadssnittens kvalité med avseende på viabilitet (med WST-1), genuttryck (med qRT-PCR), aktivitet hos utsöndrat α-amylas (α-amylas kit) samt histologiskt med light sheet fluorescence microscopy (LSFM, ett laserbaserat mikroskop som framförallt genererar 3D videor av vävnaden som sedan analyseras. Vi tog fram en metod för att få viabla vävnadssnitt i olika, förutbestämda, tjocklekar som producerade funktionellt α-amylas under en period av två dygn. För att undersöka hur lika dessa PCSS är hela spottkörtlar, utvecklade vi även metoder för att möjliggöra LSFM 3D visualisering av både hela spottkörtlar och vår PCSS-modell. Det vi såg var att med vår metod bibehölls vävnadsstrukturen i PCSS, inklusive spottkörtlarnas olika lober. Vi såg även att markörer för epitelceller i spottkörtlar (Keratin 5 och Aquaporin 5) ökade över tid i våra PCSS (undersöktes med qRT-PCR) vilket visar på att dessa celltyper, som är de celler som främst står för spottkörtelns funktion, finns kvar och lever i vår modell. Det finns några få tidigare artiklar som visar att PCSS kan tas fram, det vi har gjort är att vi har jämfört olika cellmedium för att hitta det som kan hålla PCSS vid liv samt utvecklat nya state-of-the-art analysmetoder (som LFSM 3D avbildning och qRT-PCR). Därmed har detta arbete lagt grunden för framtida användningsområden inom andra terapier i PCSS modellen (som strålbehandling eller EV-behandling) samt läkemedels-screening eller studier av skade- och sjukdomsmekanismer.

En sak vi noterade under våra in vivo- och in vitro-studier var att mycket av bedömningen, både av vävnadsskador och av läkning, görs med hjälp av histologi. Histologiska undersökningar är väldigt komplexa och subjektiva och det kan behövas många vävnadsprov för en säker diagnos. Då vi även försöker minska på de giftiga kemikalier som används i dagligt laboratoriearbete, har vi, som ett komplement, utvecklat och testat xylen-fri hantering av vävnader vid histologi och infärgning. Först behövde vi säkerställa att den xylenfria behandlingen av vävnadsproven ger pålitliga resultat. Först jämförde vi vävnad från spottkörtlar som genomgått xyleninnehållande eller xylenfri vävnadsbehandling, sedan även andra organ. Vi kom fram till att genom att byta xylen mot isopropanol och förlänga inkubationstiden samt paraffininbäddningstiden, kunde vi få bort xylen ur vävnadshanteringen utan försämrat resultat. Efter detta ville vi ta fram ett nytt och optimerat histologiskt poängsystem för en systematiserad klassificeringsmetod för vävnad. Vi gjorde först detta i lungvävnad, då vi hade många prover från just lunga, men ska framöver även använda denna klassificeringsmetod på sjukdomar i spottkörtelvävnad. Många av fenotyperna från lungvävnad kan även användas i spottkörtelvävnad (som närvaro av inflammatoriska celler eller tecken på vävnads fibros) men spottkörtelvävnad är väldigt varierad och fler histologiska prov behövs för framtida klassificering. Dock är detta viktigt för utvärdering av olika sjukdomsmodeller och framtida terapier.

Detta avhandlingsarbete har utvecklat en ny verktygslåda för in vitro och in vivo
experiment samt state-of-the-art metodologi för en bättre förståelse av de sjukdomar och sjukdomsmekanismer som kan drabba spottkörtlar samt utvärdering av nya
terapier.

• author: DONG, Jiao
• supervisor: Darcy Wagner; Kiyoshi Sakai; John Stegmayr; Hideharu Hibi
• opponent: professor Limesand, Kirsten, The University of Arizona
• organization: Lung Bioengineering and Regeneration (research group); StemTherapy: National Initiative on Stem Cells for Regenerative Therapy
• alternative title: Bioteknik och cellhärledda strategier för spottkörtelregenerering
• publishing date: 2023
• type: Thesis
• publication status: published
• subject: Cell and Molecular Biology
• keywords: extracellular vesicles, precision-cut tissue slices, histology scoring, sustainable histology, salivary gland, human dental pulp stem cells, extracellulära vesiklar, stamceller från mänsklig tandmassa, precisionsskurna vävnadsskivor, Spottkörtel, hållbar histologi och histologipoäng
• in: Lund University, Faculty of Medicine Doctoral Dissertation Series
• issue: 2023:15
• pages: 146 pages
• defense location: Join by Zoom: https://us06web.zoom.us/meeting/register/tZYvde6srT0tGdfpWt_KDTp4XVlN7o0XwWiA
• defense date: 2023-02-08 09:00:00
• ISSN: 1652-8220
• ISBN: 978-91-8021-354-7
• language: English
• LU publication?: yes
• id: 6929bb6b-1d86-4e74-8cd8-44c4dfe2cd63
• date added to LUP: 2023-01-09 07:37:34
• date last changed: 2023-02-17 14:13:01