Advanced

To reduce a ribonucleotide – Radical solutions in enzymology in form and function

Aurelius, Oskar LU (2015)
Abstract (Swedish)
Popular Abstract in Swedish

För att levande celler ska kunna föröka sig behöver förr eller senare celldelning ske. Detta är en process där en ny cell skapas utifrån den information som finnas lagrad i ursprungscellen. Denna typ av information lagras i cellens DNA. En stor del av DNA:t är ritningar för hur cellens arbetarmolekyler, proteinerna, ska byggas men DNA:t innehåller även information för reglering av denna tillverkning och hur man skapar cellernas proteinfabriker, ribosomerna.



Både DNA och proteiner är exempel på molekyler som byggs likt ett oslutet pärlband. Byggstenarna är i huvudsak lika, men har en variabel del där variation finns inom begränsningarna för ett ”kemiskt alfabet”. För DNA består... (More)
Popular Abstract in Swedish

För att levande celler ska kunna föröka sig behöver förr eller senare celldelning ske. Detta är en process där en ny cell skapas utifrån den information som finnas lagrad i ursprungscellen. Denna typ av information lagras i cellens DNA. En stor del av DNA:t är ritningar för hur cellens arbetarmolekyler, proteinerna, ska byggas men DNA:t innehåller även information för reglering av denna tillverkning och hur man skapar cellernas proteinfabriker, ribosomerna.



Både DNA och proteiner är exempel på molekyler som byggs likt ett oslutet pärlband. Byggstenarna är i huvudsak lika, men har en variabel del där variation finns inom begränsningarna för ett ”kemiskt alfabet”. För DNA består detta alfabet av fyra olika variabla delar och fungerar som bokstäver (A,T, G eller C). För proteiner är variationen större med vanligtvis 20 olika variabla ”bokstäver”. Variationen inom detta alfabet är det som ger informationsinnehållet i DNA och varje enskilt proteins unika egenskaper.



Förhållandet mellan DNA och proteiner är djupt sammanflätat och även om DNA innehåller ritningar för proteiner är det proteiner som reparerar och kopierar DNA i samband med exempelvis celldelning. En del i detta maskineri är proteinerna, ribonukleotidreduktaserna (RNR). Dessa proteiner är delaktiga i produktionen av byggmaterial till DNA. Det som utnyttjas är att byggstenarna till DNA:s systermolekyl, RNA, innehåller ytterligare en mer syreatom än motsvarande DNA byggsten.



RNR:erna tar bort en syreatom från RNA-byggstenarna och utgör därmed en del i processen att omvandla RNA-byggstenar till DNA-byggstenar. Genom att förstå hur RNR proteinerna fungerar lär vi oss mer om den komplexa reglering som sker inne i cellerna för att bibehålla balans och förmåga att föröka sig. RNR proteinerna har den imponerande egenskapen att kunna känna av sin kemiska omgivning i en process kallad allosterisk reglering. Detta medför att proteinet ”vet” ifall det finns extra mycket av någon utav byggstenarna. Ifall mycket ”A”-byggstenar finns i cellen i ett visst läge, ökar produktionen av ”C”-byggstenar istället.



I denna avhandling har två olika typer av RNR:er studerats. Den ena kommer från bakterie levandes i heta källor på havsbottnen och kan leva i miljöer helt i frånvaro av syre. Det andra RNR:et kommer ifrån en sjukdomsalstrande bakterie. Vad vi hittills lärt oss om hur dessa proteiner fungerar och ser ut presenteras i denna avhandling.



Avhandlingsarbetet utvidgar det vi vet om RNR:er aktiva i syrefria miljöer och hur ett sådant protein får sin tredimensionella struktur påverkad av sin (allostera) reglering. Det berättar också om hur detta RNR interagerar med ett hjälpprotein som krävs för funktion. Denna typ av information lär oss om hur olika organismer hittar olika lösningar under liknande, men ändock unika förutsättningar. Det lär oss också mer om det ”evolutionära bagage” dagens protein bär med sig från en tid då våra förfäders celler och likaså bakteriernas förfäder var betydligt mer lika.



Det andra RNR:et från den sjukdomsalstrande bakterien visar också på hur reglering av dessa proteiner kan få stor effekt på deras struktur. Denna strukturella information hjälper oss att se likheter och skillnader mot vårt egna mänskliga RNR. Att förstå skillnaderna öppnar för möjligheten att utveckla läkemedel direkt riktade mot bakterien, utan att störa vårt egna RNR. Detta skulle göra det möjligt att slå ut bakteriens förmåga att exempelvis genomgå celldelning utan att utgöra någon risk för patienten som äter medicinen.



Att skänka sina egna RNR molekyler en god tanke, är kanske inte en dålig idé. De sliter trots allt, dag ut och dag in, för att tillgodose våra cellers behov för reparation, expansion och förnyelse! (Less)
Abstract
It has been more than 50 years since the enzyme system ribonucleotide reductase (RNR), catalysing the reduction of ribonucleotides to deoxyribonucleotides, was first discovered. RNR was also the first time that radical chemistry was revealed in an enzyme. RNRs carry out a key step in the de novo synthesis of building blocks for DNA and have been found in almost all known organisms.



Within this thesis the anaerobic RNR from the thermophilic bacteria Thermotoga maritima has been studied by making use of X-ray crystallography, anaerobic enzyme assays, small-angle X-ray scattering and complementary biophysical methods. The crystal structure of the catalytic subunit of this anaerobic RNR stood out by lacking the typical... (More)
It has been more than 50 years since the enzyme system ribonucleotide reductase (RNR), catalysing the reduction of ribonucleotides to deoxyribonucleotides, was first discovered. RNR was also the first time that radical chemistry was revealed in an enzyme. RNRs carry out a key step in the de novo synthesis of building blocks for DNA and have been found in almost all known organisms.



Within this thesis the anaerobic RNR from the thermophilic bacteria Thermotoga maritima has been studied by making use of X-ray crystallography, anaerobic enzyme assays, small-angle X-ray scattering and complementary biophysical methods. The crystal structure of the catalytic subunit of this anaerobic RNR stood out by lacking the typical cysteine residue, which takes part in radical transfer to the substrate, positioned in its active site. The opposing site for the glycyl radical was however structurally conserved, as in structures of other glycyl radical enzymes. It was shown that the glycyl radical could be generated by the addition of the radical generating subunit with a reduced Fe4S4 cluster and the co-substrate S-adenosyl methionine. By also adding T. maritima cell extracts it was verified that the system was an active RNR.



Further work focused on understanding complex formation between the two subunits and the structural manifestation of allosteric regulation. Anaerobic analytical ultracentrifugation indicated that a dimer of the catalytic subunit interacts with a monomer of the radical generating subunit. Crystal structures of the catalytic subunit in complex with various nucleotides were used to compare hydrogen bonding networks and nucleotide recognition for allosteric regulation.



The second model system studied was the Pseudomonas aeruginosa aerobic RNR catalytic subunit. Proteins from P. aeruginosa are of clinical interest as possible drug targets, due to the many human infections caused by this microorganism. By solving the crystal structure of the catalytic subunit in complex with dATP it became possible to visualise its tetramerisation interface and its surprising capacity to bind three dATP molecules over two ATP cones per monomer.



This work shows how RNRs, present in very different types of organisms, still keep on delivering surprises and different solutions to the complexity of synthesising deoxyribonucleotides and regulating nucleotide pools in the cells. (Less)
Please use this url to cite or link to this publication:
author
supervisor
opponent
  • Dr Egeskov Brodersen, Ditlev, Department of Molecular Biology and Genetics - Structural Biology, Aarhus University, Aarhus, Denmark
organization
publishing date
type
Thesis
publication status
published
subject
keywords
Ribonucleotide reductase, X-ray crystallography, Small-angle X-ray scattering, nucleotide metabolism, protein biophysics, metalloproteins, anaerobic enzymology
pages
211 pages
publisher
Department of Biochemistry and Structural Biology, Lund University
defense location
Ekologihuset, Blå Hallen
defense date
2015-11-10 13:00
ISBN
978-91-7422-412-2
language
English
LU publication?
yes
id
a075303b-0c8d-4470-8a18-4022a2a884ca (old id 8055944)
date added to LUP
2015-10-16 16:12:25
date last changed
2016-09-19 08:45:08
@phdthesis{a075303b-0c8d-4470-8a18-4022a2a884ca,
  abstract     = {It has been more than 50 years since the enzyme system ribonucleotide reductase (RNR), catalysing the reduction of ribonucleotides to deoxyribonucleotides, was first discovered. RNR was also the first time that radical chemistry was revealed in an enzyme. RNRs carry out a key step in the de novo synthesis of building blocks for DNA and have been found in almost all known organisms.<br/><br>
<br/><br>
Within this thesis the anaerobic RNR from the thermophilic bacteria Thermotoga maritima has been studied by making use of X-ray crystallography, anaerobic enzyme assays, small-angle X-ray scattering and complementary biophysical methods. The crystal structure of the catalytic subunit of this anaerobic RNR stood out by lacking the typical cysteine residue, which takes part in radical transfer to the substrate, positioned in its active site. The opposing site for the glycyl radical was however structurally conserved, as in structures of other glycyl radical enzymes. It was shown that the glycyl radical could be generated by the addition of the radical generating subunit with a reduced Fe4S4 cluster and the co-substrate S-adenosyl methionine. By also adding T. maritima cell extracts it was verified that the system was an active RNR.<br/><br>
<br/><br>
Further work focused on understanding complex formation between the two subunits and the structural manifestation of allosteric regulation. Anaerobic analytical ultracentrifugation indicated that a dimer of the catalytic subunit interacts with a monomer of the radical generating subunit. Crystal structures of the catalytic subunit in complex with various nucleotides were used to compare hydrogen bonding networks and nucleotide recognition for allosteric regulation.<br/><br>
<br/><br>
The second model system studied was the Pseudomonas aeruginosa aerobic RNR catalytic subunit. Proteins from P. aeruginosa are of clinical interest as possible drug targets, due to the many human infections caused by this microorganism. By solving the crystal structure of the catalytic subunit in complex with dATP it became possible to visualise its tetramerisation interface and its surprising capacity to bind three dATP molecules over two ATP cones per monomer.<br/><br>
<br/><br>
This work shows how RNRs, present in very different types of organisms, still keep on delivering surprises and different solutions to the complexity of synthesising deoxyribonucleotides and regulating nucleotide pools in the cells.},
  author       = {Aurelius, Oskar},
  isbn         = {978-91-7422-412-2},
  keyword      = {Ribonucleotide reductase,X-ray crystallography,Small-angle X-ray scattering,nucleotide metabolism,protein biophysics,metalloproteins,anaerobic enzymology},
  language     = {eng},
  pages        = {211},
  publisher    = {Department of Biochemistry and Structural Biology, Lund University},
  school       = {Lund University},
  title        = {To reduce a ribonucleotide – Radical solutions in enzymology in form and function},
  year         = {2015},
}